Hielscher Хэт авианы технологи

Хэт авианы протеинийг эд ба эсийн соёлоос олборлодог

  • Protein олборлолт нь протомомикс дахь дээж бэлтгэх чухал алхам юм.
  • Уургууд нь ургамлын болон амьтны эдээс, мөөгөнцөр, бичил биетнээс гаргаж авч болно.
  • Sonication нь найдвартай, үр ашигтай уургийн олборлолтын арга юм.

 

Уураг нь эд, эсээс гаргаж авдаг

Эмийн болон эсийн эсээс уургийн олборлолт нь ELISA, PAGE, Баруун бүслүүр, масс спектрометр, уургийн цэвэршүүлэлт. Хэт авианы эсийн тасалдал, лизис, олборлолт уургийн өндөр ургацыг хангах нарийн хяналтын арга юм.

Амьтны эдээс уураг гаргаж авах

Бүхэл бүтэн эдийг (жишээ нь бөөр, зүрх, уушиг, булчин г.м) бэлдэхэд эдийг маш жижиг хэсгүүдэд мөсөөр цэвэрлэж, протеазуудаар доройтохоос сэргийлж липидийн буфер, протеаза, фосфатаза дарангуйлагч коктейль агуулсан гипотоник лизис буфер зэрэг). Дээжийг задалсны дараа дээжийг гэнэтийн хөлдөөх азотын шингэн рүү дүрнэ. Дээжийг дараа нь -80 ° C-д хадгалж, нэгэн төрлийн болгосноор мөсөн дээр шууд хүлээн зөвшөөрнө. Хэт авианы олборлолтоос өмнө мөс хүйтэн лизентын буфер (протеаза дарангуйлагчтай ДТТ, липептин ба алкатинин) бүхий дээжийн хоолойд (10мг ~ 600 мкл-ийн буфер тутамд нэмж өгдөг). Ойролцоогоор 20-60мг-ийн эдийг дээжийн хоолой бүрт зөвлөж байна.
Хэт авианы нэгэн төрлийн болгодог, лизис, олборлолт зэрэг хэт авианы нэгэн төрлийн болгодог Uf200 ः т эсвэл UP200St, микро-үзүүртэй sonotrode тоноглогдсон. Sonication хугацаа 60-90 сек. 15 секундын хэт авианы эргэлтийн горим дээр. sonication ба 10 секунд. амрах цаг. Дээжийг бүх мөсөн хугацаанд хадгална.
Хэт авианы гомогенжүүлэлт / олборлолтын дараа лизатад ойролцоогоор 27,000 граммаар центрифугдэж байна. 20 мин. Үүний дараа уургийн концентрацийг Пирс уургийн шинжилгээгээр BCA зэрэг уургийн шинжилгээгээр тодорхойлж болно.

Уургийн sonication нь дээж бэлтгэх чухал арга юм

Нүднээс хэт авианы уураг гаргаж авах UP200St

Мэдээллийн хүсэлт




Бидний анхаарна уу Нууцлалын бодлого.


Цусны ийлдсэнээс уураг авах

Сийвэнгийн болон фосфатын буферийг нэгэн төрлийн хольцтойгоор дээжийг хэт авианы эсийн лизисээс өмнө түрхэнэ. Хэт авианы lysis хувьд, дээж нь хэт авианы лаборатор нэгэн төрлийн болгодог sonicated байна UP100H 20 удаагийн далайцтай 8 цикл, 5 секунд тутамд, 15 секундын цикл бүрийн хувьд. Sonocation нь sonicationg-ийн мөчлөгөөр явагддаг бөгөөд дээжийг хэт халалт, дулааны доройтлоос зайлсхийх зорилгоор дээжийг мөс дээр байрлуулах замаар гүйцэтгэнэ. Сийвэн нь өндөр молекулын уургийн агууламжтай байдаг (жишээ нь альбумин, α1-antитримоцин, шилжүүлэнг агуулах, haptoglobulin, иммуноглобулин G, иммуноглобулин А) зэрэг нь ихэвчлэн IEF-ийн үед бага молекул жингийн уурагуудыг салгахад нөлөөлдөг тул тэдгээрийг бууруулах Сийвэнгийн баганын хомсдолыг ашиглана.

Ургамлын эд эсээс уураг гаргаж авах

Шинэхэн, зөөлөн ургамлын эд, жишээ нь, хөвд г.м., sonication нь лизен буфер дахь жижиглэсэн дээжийг байрлуулж хялбархан задарч болно. Үр тариа, гацуур гэх мэт ургамалын эд эсүүд хатуурсан байх ёстой. Зарим хатуу, модлог ургамлын материалыг хөлдөөж хөлдөөж, sonication ашиглан олборлохын өмнө шингэн азотод газар дээр нь байх ёстой. Ургамлын эсийн суспензийн хувьд лизенцийн буфер дахь 30-150 секундын хооронд хэт авианы эмчилгээ ихэвчлэн хангалттай байдаг. Хулууны үр гэх мэт хатуу материалыг доор тайлбарласан илүү хүчтэй sonication шаарддаг.

Хулууны үрнээс цомининыг хэт авианы олборлолтын протокол

S24d40 нь хэт авианы эд нийлэгжүүлэгч UP400St - ургамлын болон амьтны эдээс уургийн олборлолтын хувьд (дарж томруулна уу!)Нарийн хөрсөнд хулууны үрийн нунтагоос 10кг дутагдалтай уургийн хандлалт, ууссан хулуу үрийн нунтаг 10г, 100 мл ионгүйжүүлсэн усыг 250мл шилэн стаканд нэмнэ. Уургийн олборлолт нь хоёр үе шаттай. Үүнд: Нэгдүгээрт, дээжийг хэт авианы аппаратаар шалгадаг UP400St (400W, 24kHz) холбогдсон sonotrode S24d7. Шилэн стакан нь хэт авианы нэгэн төрлийн бүтэцтэй үед хүйтэн усан ваннд байрлуулсан байна. Ultrasonicator тохиргоо UP400St Туршилтын температурыг 30 ° C-аас бага байлгахын тулд температур хэмжигчийг ашиглана. Sonication-ийн үед температур хянагч нарийвчлалтайгаар альбининыг денатураци хийхээс зайлсхийдэг. Хоёрдугаарт, олборлолт нь 200 минутын хурдтай, 30 0С-т холигчоор хийгдсэн. Дараа нь шилэн нь термостатик сэгсрэгч рүү шилжинэ. Глобулиныг нэрмэл усаар диализаар зайлуулна. Глобулины арилгасны дараа уургийн хандыг альбумины шинж чанарыг тодорхойлохын тулд дээж авч болно. Дараа нь pI = 3.0-д 0.1 М HCl ашиглан альбумины бүлгийн коагуляцийг ашиглан тохируулна. Хатуу фазыг 5000г, 20 ° C-т центрифугт тусгаарлаж, ионгүйжүүлсэн усанд дахин уусгасан байна. Albumin-ийн концентраци дахь уургийн харьцааг ихэсгэхийн тулд albumin-ийн бүлэгнэлийг хоёр удаа хийнэ.

Хэт авианы эмчилгээ нь уураг баяжуулсан бэлдмэлийн хувьд хэт авианы шүлтлэг уургийг гаргаж авах нь хэт авианы эмчилгээ нь маш бага хугацаанд олборлох хугацааг өндөр уургийн гарц үүсгэдэг болохыг харуулж байна – ердийн олборлолтын аргуудтай харьцуулахад.

Хэт авианы төхөөрөмж VialTweeter эд дээжээс уураг олборлоход зориулагдсан (дарж томруулна уу!)

VialTweeter шууд бус sonication.

Давуу талууд

  • хурдацтай
  • өндөр ургац
  • өндөр үр ашигтай
  • Параметрүүдийг нарийн хянах
  • дахин боловсруулсан үр дүн
  • шугаман хамаарал

Функциональ iNOS ферментийн дээж бэлтгэх протокол

Бүрэн ажиллагаатай iNOS ферментийг авахын тулд дараахь протоколыг зөвлөж байна. Үүнд: Мөсөн суспензийг мөсөн дээр тавьж, sonicate UP100H 10мм-ийн далайцтай 5 секундын мөчлөгийн горимд байна. sonication ба 25 сек. мөсөн дээр амрах. Уг процедурыг ойролцоогоор дахин давтах хэрэгтэй. 3 удаа. Sonication мөчлөгийн хоорондох амралтын цаг нь температурын өсөлтийг бууруулж, денатурацийн эрсдэлийг бууруулдаг.

Хэт авианы Protein Solubilization

Sonication нь ихэвчлэн хэд хэдэн цаг шаарддаг уургийн уусмалыг боловсруулдаг. Дээжийг хэт халаахгүйн тулд уургийн доройтол, мочевин агуулсан уусмал дахь өөрчлөлтийг зогсоохгүйн тулд хэт авианы тэсрэлт нь хэдэн секундээс удаан үргэлжилдэггүй.

Ерөнхий заавар

Температурын хяналт: Дулааны дисперсгүйгээр өндөр уургийн гарцыг хангахын тулд олборлолтын үед температурыг хянаж байх ёстой. Hielscher-ийн хамгийн сүүлийн үеийн хэт авианы нэгэн төрлийн болгодог – Мөн ultrasonic disintegrator эсвэл sonificator гэж нэрлэдэг – нарийн хянагддаг. Тэд температур хэмжигчтэй. Хэт авианы нэгэн төрлийн болгодог тохиргоонд хамгийн дээд температурыг тохируулж болно. Энэ температурт хүрэх үед дээж хөргөх хүртэл ultrasonicator автоматаар зогсдог.
Буфер: Тохирох буфер болон зөв буферын сонголт нь эдээс эд эсээс ялгаатай бөгөөд туршилт-алдааны туршилтаар тодорхойлогддог.
Тусгаарлах / цэвэршүүлэх: Уургийн лизатууд ДНХ эсвэл нүүрс ус зэрэг биомолкулиудаас илүүдэл агуулагдаж байж болох ба энэ нь уураг хур тунадас (deoxycholate-trichloroacetic acid) буюу буфер солилцоооор устгаж болно.

Chittapalo, Noomhorm (2009) нарын мэдээлснээр уургийн гарц нь sonication ашиглан нэмэгдэж, хэт авианы эд нэгдлүүд болон лизенцийн процесс нь одоо байгаа олборлолтын үйл явцыг ихэсгэх боломжтой гэж мэдээлсэн. – шинэ арилжааны олборлох боломжуудыг бий болгох боломжийг олгож байна.

Hielscher-ийн дууны хашааг SPB-L болон хэт авианы төхөөрөмж UP200St-тэй хамтаар хамгаалах. (Дарна уу!)

Хэт авианы эд нэгэн төрлийн болгогч UP200St үр ашигтай уургийн олборлолтын хувьд

Хэт авианы эмчилгээний нарийн хяналт (томруулж дарна уу!)

Sonication үйл явцын нарийвчилсан ажиллагаа, мониторингийн хөтөчийн хяналт

Protein Extraction нь хэт авианы тоног төхөөрөмж

Hielscher Ultrasonics нь эс, эд, нян, микроорганизм, мөөгөнцөр, спорыг задалдаг хэт авианы нэгэн төрлийн болгодог.
Hielscher лабораторийн ultrasonicators хүчирхэг, ажиллахад хялбар байдаг. 24 цагийн туршид зориулж бүтээгдсэн бөгөөд тэдгээр нь бат бөх, үр дүнтэй лаборатори, вандан сандал бүхий төхөөрөмжүүд юм. Бүх төхөөрөмжүүдийн хувьд эрчим хүчний гаралт болон далайцыг нарийн хянаж болно. Олон төрлийн Дагалдах хэрэгсэл нэмэлт тохиргоог нээнэ. Зэрэг дижитал төхөөрөмжүүд VialTweeter, Uf200 ः т, UP200Stболон UP400St Температурын хяналт, автоматжуулсан SD карттай байх.
Олон тооны дээжүүдийн шууд бус, бохирдлоос ангид, нэгэн зэрэг sonication-д зориулсан VialTweeter эсвэл Хэт авианы cuphorn.
Таны аппликешн, материал, дээжийн хэмжээнээс шалтгаалан бид танд дээж бэлтгэх хамгийн тохиромжтой тохиргоог санал болгож байна. Бидэнтэй холбоо бариарай!

Холбоо барих! / АНУ-ын асуу!

Та хэт авианы нэгэн төрлийн талаар нэмэлт мэдээлэл шаардах хүсвэл доорх маягтыг ашиглана уу. Бид танд таны хайсан үгийн хангасан нь хэт авианы системийг санал болгож баяртай байх болно.









Биднийг анхаарна уу Нууцлалын бодлого.


Уран зохиол / Ашигласан материал

  • Chittapalo T, Noomhorm A (2009): Хэт авианы тусламжтайгаар шүлтийн хольцыг уураггүй цагаан будааны хивэг болон уургийн баяжмалын шинж чанараас ялгаж авдаг. Int J Food Sciol 44: 1843-1849.
  • Simões, André ES :; Перейра, Diane M .; Amaral, Joana D .; Nunes, Ana F .; Гомес, София Е .; Родригуд, Питер М .; Ло, Adrian C .; D'Hooge, Руди; Steer, Clifford J .; Thibodeau, Стефен Н .; Borralho, Pedro M .; Rodrigues, Cecilia MP (2013): Трезол эсвэл trizol LS RNA хандлалт болон урт хугацааны хадгалалтын дараа олон эх үүсвэрээс авсан уургийг үр дүнтэй сэргээх. BMC Genomics 2013, 14: 181.


Баримтууд үнэ мэдэх

Протомикууд

Протомомикууд нь уургууд ба протеомийг шинжлэх судалгааны талбар юм. Протеинууд нь организмын доторх чухал үүрэг гүйцэтгэдэг. Уураг нь геном, эс, эд, эсвэл организм тодорхой хугацаанд тодорхойлсон уургийн бүхэл цогц юм. Уураг нь цаг хугацаа болон ялгаатай шаардлага, эсвэл стрессийг өөр өөр байдаг. Илүү онцлог нь тодорхой өгөгдсөн нөхцөлд тодорхой хугацаанд өгөгдсөн төрлийн эс буюу организмд илэрхийлэгдсэн уурагуудын багц юм. Энэ нэр томъёо нь уураг ба геномын холимог юм. Протоми бол протеомын судалгаа юм.

Уураг

Уургууд нь макромолкулууд гэж нэрлэгддэг том биомолекулууд юм – Энэ нь амин хүчлийн үлдэгдэл нэг буюу хэд хэдэн урт гинжнээс бүрдэнэ. Уургууд нь ургамлын болон амьтны аль алины бүх организмд байдаг бөгөөд эдгээр нь ихэнх биологийн функцүүдэд чухал үүрэг гүйцэтгэдэг. Уургууд нь маш олон биологийн мэдээллийг агуулдаг тул тэдгээрийг задлан шинжилгээний зориулалтаар гаргаж авдаг, тухайлбал протомомын судалгаанд хэрэглэдэг. Уураг хийж гүйцэтгэдэг хамгийн чухал үүрэг нь бодисын солилцооны урвал, ДНХ-ийн хуулбар, урвалын хариу үйлдэл, молекулыг нэг байрлалаас нөгөөд шилжүүлэх зэрэг орно. Уургууд нь бие биенээсээ ялгаатай байдаг. Тэдний генийн нуклеотидын дараалалаар тодорхойлогддог амин хүчлүүдийн дарааллаар ялгаатай байдаг бөгөөд энэ нь уураг нуклеотидын үйл ажиллагааг тодорхойлдог гурван хэмжээст бүтцэд нөлөөлдөг. Уураг нь – пептидээс гадна – хоол хүнсээр хангах гол бүрэлдэхүүн хэсгүүдийн нэг юм. Тиймээс протомомикс нь хүнсний шинжлэх ухаан, процесс, хүнсний аюулгүй байдал, хоол тэжээлийн үнэлэмжийг оновчтой болгох хүчирхэг хэрэгсэл юм.

Гель электрофорез

Гель электрофорез нь ДНХ, РНХ, уураг зэрэг макромолекулуудыг задлан шинжилэх, тэдгээрийн хэмжээ, цэнэгийн хэмжээгээр нь ялгах гол арга юм. ДНХ-ийн хэмжээний хэмжээг тооцоолохын тулд уураг задлах болон / эсвэл хэмжээсээр (уураг агар), биохими, молекулын биологи, протомомикууд нь холимог популяци, ба РНХ-ийн фрагментууд эсвэл уурагуудыг тус тусад нь тусгаарлана.

Эсийн соёл

Эсийн соёололт нь хяналттай нөхцөлд эсийг тариалах хяналттай өсөн нэмэгдэж буй процесс юм. Cell эсийн нөхцөл байдал нь эсийн төрлөөс хамааран янз бүр байдаг. Ерөнхийдөө эсийн өсгөвөрийн орчин нь тэжээллэг бодис (амин хүчил, нүүрс ус, витамин, эрдэс бодис), өсөлтийн хүчин зүйл, даавар, хий (CO2, Өө2), физик-химийн орчин (рН буфер, osmotic даралт, температур) зохицуулдаг. Ихэнх эсүүд нь гадаргуу эсвэл хиймэл субстратыг шаарддаг бол бусад эсийн өсгөвөрт чөлөөтэй ургах чадвартай (суспензийн өсгөвөр, эсийн түдгэлзүүлэлт).
Малын эсийн шугамын массивыг вирусийн вакцин болон бусад биотехнологийн гаралтай бүтээгдэхүүн үйлдвэрлэхэд ашигладаг. Хүний үүдэл эсүүд нь эсийн тоог өргөжүүлж, эсийг шилжүүлэн суулгах төрөл бүрийн соматик эсийн төрлүүдийг ялгаж ангилдаг.

Эмийн дээжүүд

Тест гэдэг нь эсийн завсрын завсрын хэсгийг тодорхойлж өгдөг. Энд эсүүд нь эсийн хоорондох зохион байгуулалтын түвшин, бүрэн эрхтэнтэй байдаг. Эквадор, ижил төстэй эсүүд, хамтдаа нэг онцлог функцийг гарган авч угсардаг. Олон эд эсийн функционал бүлэглэлээр эрхтэнүүдийн цогц бүтэц бий болдог.
Биологийн биологи, гистологи / гистопатологи, паразитологи, биохими, иммуногистохими, мөн ДНХ-ийг ялгах, судлах зорилгоор түүвэрлэсэн. Энэ нь амьтны (хуваагдал: хөхтөн эд), ургамлын эд эрхтэнээс ялгарч болно. Малын эдийг холбогч, булчин, мэдрэлийн болон эпителийн эдээс хамаарах үндсэн дөрвөн төрөлд хуваадаг. Ургамлын эдийг дараах гурван эд эсэд хуваасан: эпидерми, газрын эд, судасны эд.
Дээжний эдийг яс, булчин, навч гэх мэт амьтан, ургамлын хэсгээс бэлтгэж болно.

Биеийн шингэн

Цус, ийлдэс, плазм, тархи, шингэн, шүлс, synovial шингэн нь бие махбодийн шингэн бөгөөд оношлогооны холбогдох мэдээллийн маш сайн эх сурвалж болдог. Тиймээс шинжилгээнд зориулж биеийн шингэний дээжийг нарийн боловсруулах нь чухал юм. Эхний хүндрэл нь биеийн шингэнд агуулагдах бүрэлдэхүүн хэсгүүдийн өргөн динамик хэсэгтэй холбоотой байдаг.

А уургийн агууламжийг тодорхойлох

Брэдфордын шинжилгээгээр, Lowry сорьц ба биикинсониний хүчил (BCA) нь уургийн концентрацийг тодорхойлох нийтлэг сорилт юм. Үхэр нь сийвэнгийн альбумин (BSA) нь хамгийн их ашиглагддаг уургийн стандартуудын нэг юм.

Lysis Buffer

Лислийн буфер нь эсийн материал, эд эсийн (эд эс, ургамал, бактери, мөөгөнцөр гэх мэт), эсийн бүтэц, бүтцийн төрлөөс хамааран сонгох ёстой. Уураг, мембран, бие организмыг олборлож авахад зориулсан олон тооны лизенцийн буферууд нэг буюу хэд хэдэн угаалгын бодисоор боловсруулагдана. Ариутгагчийг ихэвчлэн туршилтын болон алдааны туршилтаар эсвэл сонгосон сорилоор сонгоно – Хэрэв боломжтой бол – одоо байгаа уургийн олборлолтын протоколын дагуу. Ариутгагч нь эд эсийн эх үүсвэр болон уурагуудтай нийцтэй байх ёстой. Ерөнхийдөө тодорхой нэг эд / уураг үйлдвэрлэхэд тохиромжтой хамгийн зөөлөн бодисыг сонгож авсны хамгийн их ажиллагаатай байлгахын тулд сонгож авдаг. Цаашилбал, мембраны болон органик уусмалыг ууж байгаа тохиолдолд бага зэргийн угаалгын нунтаг нь мембраныг бүрэн бүтэн байлгадаг. Лизийн буферуудэд түгээмэл хэрэглэгддэг бодисууд нь ихэвчлэн бусдаас ялгагдах шинж чанаргүй, эсвэл трактон, Тритон ™ X-100, NP40, Тин 20 гэх мэт.
Жишээлбэл, тархи, элэг, гэдэс, бөөр, дэлүү гэх мэт эд эсүүд нь зүгээр л RIPA – Гэсэн хэдий ч протеаз дарангуйлагчид болон ДТТ (гель электрофорезийн хувьд) орно.
Араг ясны булчингийн эдийг (мөс хүйтэн): 20 мкм Трис (рН 7.8), 137 мл NaCl, 2.7 мм КCl, 1 мг MgCl2, 1% Triton X-100, 10% (w / v) глицерол, 1 мМ Трилон , 1 мг dithiothreitol, протеаз ба фосфатаза дарангуйлагч коктейль агуулсан
Нийтлэг буферууд ба тэдгээрийн рН муж. Ерөнхийдөө эдгээр буферуудыг ихэвчлэн 20-50 мм концентрацид хэрэглэдэг.

Буфер pH хүрээ
Нимбэгийн хүчил – NaOH 2.2 – 6.5
Натрийн цитрат – Нимбэгийн хүчил 3.0 – 6.2
Натрийн ацетат – Цууны хүчил 3.6 – 5.6
Cacodylic acid sodium salt – HCl 5.0 – 7.4
MES – NaOH 5.6 – 6.8
Натрийн азотын фосфат – натрийн устөрөгчийн фосфат 5.8 – 8.0
Imidazole – HCl 6.2 – 7.8
Хөдөлмөрийн зах зээл – KOH 6.6 – 7.8
Триетаноламин гидрохлорид – NaOH 6.8 – 8.8
Трис – HCl 7.0 – 9.0
HEPES – NaOH 7.2 – 8.2
Tricine – NaOH 7.6 – 8.6
Натрийн тетраборат – борын хүчил 7.6 – 9.2
Bicine – NaOH 7.7 – 8.9
Гликин – NaOH 8.6 – 10.6

Ихэнх буферууд нь температуртай рН-хамаарлаас харагддаг. Энэ нь ялангуяа Tris буфферуудад үнэн юм. PKa 8.06-аас 25 0С-ээс 8.85 хүртэл 0 ° С-т өөрчлөгдөнө.
(рН ба pKa буфер: рН нь усан уусмал дахь устөрөгчийн ионы концентрацийг хэмждэг. pKa (= хүчиллэг задрал тогтмолжуулалт) нь хамааралтай, гэхдээ илүү тодорхой арга хэмжээ бөгөөд энэ нь тодорхой молекул дээр хэрхэн ажиллах талаар урьдчилан таамаглахад тусалдаг рН утга).

TRIzol

TRIzol нь guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform олборлолтын үед РНХ / ДНХ / уургийг гаргаж авахад хэрэглэгддэг химийн шийдэл юм. Хэт авиан шинжилгээнд TRIzol хандалтыг ашиглах нь ДНХ, РНХ, уургийн гарцыг ижил дээжнээс гаргаж авдаг бөгөөд ингэснээр бусад хандлах аргууд байдаг.