Hielscher Хэт авианы технологи

Савханцрын Хэт авианы лизис

  • E. coli бактери нь микробиологи ба биотехнологийн хамгийн түгээмэл бактер юм.
  • Хэт авианы эсийн дарангуйлагчид E. coli-ийн лизентэд найдвартай, дахин давтагдах үр дүнг хүргэдэг.
  • Нарийхан боловч нарийн хянадаг хөөсрөлт ба зүслэгийн хүч нь бүрэн тасалдал, олборлолтын өндөр ургац (жишээ нь, уураг, ДНХ) үүсдэг.

Ховилон бүлгийг тасалдуулах

Escherichia coli бактери нь хэт авианы эд нэгэн төрлийн үүсгэгч ашиглан найдвартай байдаг.Хэт авианы сорьцын төрөл гомогенжүүд нь ойролцоогоор ажилладаг. Секундэд 20,000 цикл (20 кГц-ийн үед) шингэн болон шингэний хонгилыг үүсгэдэг. Акустик хөөсөнцөр микроскопууд нь вакуум шиг даралттай, эсүүд урсана. Хэдийгээр температур хэд хэдэн мянган градус хүрч болох боловч хагарал ихтэй байдаг тул энэ процессыг ихээхэн халаахгүй. Эко-флотын эсийн мембраныг эвдэж эсвэл эвдэж хэт авианы аппаратын хөндлөвч, зүсэх хүчийг үүсгэсэн – хэт авианы нэгэн төрлийн төхөөрөмжийн тохиргооноос хамааран.

Хэт авианы Lysis давуу тал

  • лизийн нарийн хяналт (эрчим, далайц, температур)
  • тодорхой дээжинд оновчтой дасан зохицох
  • температурын хяналт
  • маш жижиг дээж (μL хүртэл литр)
  • цэвэр механик эмчилгээ
  • лабораторийн үйлдвэрлэл хүртэл шугаман хуваарилалт
VialTweeter хэт авианы төхөөрөмж нь ижил процессын нөхцөлд 10 хуруу шилийг зэрэгцээ бэлтгэх боломжийг олгодог. (Дарна уу!)

VialTweeter хэт авианы лиз

Мэдээллийн хүсэлт




Бидний анхаарна уу Нууцлалын бодлого.


Хими ба ферментийн лизис нь хүндрэлтэй байж болно – химийн лизис нь уургийн бүтцийг өөрчилснөөр цэвэршүүлэх асуудал, ферментийн лизисийг урт инкубацийн хугацаа шаарддаг, дахин боловсруулж чаддаггүй – Хэт авианы тасалдал нь маш нарийн, хурдан эсийн тасалдлын арга юм.
Хэт авианы лизис нь зөвхөн механик хүчинд тулгуурладаг. Химийн бодис нэмэгдэхгүй, sonication нь эсийн ханыг шилжилтийн хүчээр эвддэг. Химийн задрал нь уургийн бүтцийг өөрчилж, цэвэршүүлэх асуудал үүсгэдэг. Ферментийн эмгэг нь удаан хугацаагаар инкубац хийхийг шаарддаг бөгөөд дахин бүтээгддэггүй.

Ерөнхий зөвлөмжүүд

Реактортой UP400St ultrasonicatorSonication нь маш жижиг, дунд, их хэмжээний эсийн түдгэлзүүлэлтийг залгах хамгийн түгээмэл арга юм – 100л / цаг хүртэл пико-литрээс (хэт авианы урсгал эсийг ашиглана). Шинжилгээнд эсүүд нь шингэн зүслэг, хагарал үүссэн байдаг. ДНХ-ийг sonication үед бас хянаж байх тул DNase-ийг эсийн суспенз рүү нэмэх шаардлагагүй.
Температурын хяналт:
Дээжийг хөргөх, мөсөн дээр sonication үед дээжийг хадгалах замаар дээжийн дулааны доройтол дээжийг хялбархан арилгаж болно.
Дээжийг лизентэй үед дээжийг мөсний хүйтэн байлгах хэрэгтэй, гэхдээ ихэнх сорьцод температур, соёлын эх үүсвэрийн температураас дээш гарахгүй байвал хангалттай. Тиймээс мөстлөгийн мөчлөгийг зогсоож, хэд хэдэн богино хэт авианы цохилтыг 5-10 секунд, 10-30 секундын хурдтайгаар sonicate байлгахыг зөвлөж байна. Хог хаягдлыг түр зогсоох үед халалт нь бага температурыг бий болгохын тулд алга болно. Том хэмжээний дээжний хувьд хөргөлтийн хүрэмтэй янз бүрийн урвалын эсийн реакторууд байдаг.

E. Coli Lysates бэлтгэх протокол

Рекомбинант уургийн илэрхийлэл ба цэвэршүүлэлт

E. coli пеллет хэт авианы системтэй sonicated байна UP100H (Hielscher). Үүний тулд эсийн хөргөгчинд дүүргэсэн лизенцийн буфер (50 мг Трис-HCl рН = 7.5, 100 мА NaCl, 5мM ДТТ, 1мМНФСФ), 10 минутын турш хөргөнө. Дараа нь эсийн түдгэлзүүлэлт нь 10 секундын 10 секундын нарийвчлалтайгаар, дараа нь 30 секундын турш хөргөлтийг авна. Эцэст нь эсийн хог хаягдлыг ultracentrifugation-ээр 14000 минутын турш 15 минутын турш 15 минутын турш зайлуулсан. РPR илэрхийлэлийг батлахын тулд тунг 12% -ийн polyacrylamide гель дээр ажиллуулж SDS-PAGE болон Western blotting-аар шинжлэв. RPR-ийн ариутгалыг Ni-г ашиглан хийсэн2+-NTA давирхай (АНУ-ын Invitrogen) үйлдвэрлэгчийн зааврын дагуу. Энэ шатанд уугуул цэвэршүүлэх арга хэрэглэсэн. Цэвэршүүлсэн уургийн цэвэршилт 12% -ийн полакаприламидийн гель, дараа нь Коомасси хөх будалтанд электрофорез ашиглан үнэлэгдсэн. Цэвэршүүлсэн уургийн концентрацийг микрон BCA уургийн шинжилгээний багажаар (АНУ, PIERCE) хэмжсэн. (Azarnezhad нар, 2016)

Хэт авианы эсийн тээглүүр UP100H (100W) лизис, эсийн тасалдал, ДНХ хяргах.

Хэт авианы нэгэн төрлийн болгогч UP100H (100W)

Эсийн колий эсийн эсийг өсгөх, хөндлөн холбох, бэлдэх

SeqA болон RNA полимеразын Chip-Chip E. coli MG1655 эсвэл MG1655 ΔseqA нь 37 ° C-д OD600 0,1 мл 50 мл ЛБ (+ 0.2% глюкоз) 27 мкл формальдегидийн (37%) -ийг нэмсэн (эцсийн концентраци 1%) өмнө нэмнэ. Crosslinking нь 20 минутын турш аажмаар сэгсэрч (100 rpm), дараа нь 10 мл 2,5 М гликин (эцсийн концентраци 0.5 М) -тай цангасан. Дулаан цохилтын туршилтанд E. coli MG1655 нь 65 мл LB орчинд 30 0С-ийн температурт өсгөвөрлөнө600 0.3 орчим байна. Дараа нь 30 мл-ийн өсгөвөрлөлтийг урьдчилан халаах колбонд 43 0С-т, үлдсэнийг нь 30 0С-т хадгална. Дээр дурьдсанчлан хөндлөн холбох, бөхөн суулгах зэрэг нь тасалгааны температурт удаан аажмаар сэгсрэхээс өмнө 30 минут буюу 43 0С-т байлгахаас бусад тохиолдолд 5 минутын турш хадгална. Сүлжээнүүдийг центрифугт цуглуулж, хүйтэн TBS (pH7.5) -аар хоёр удаа угаана. 1 мл лизенцийн буфер (10 мкг Трис (рН 8.0), 20 мл сахароз, 50 мл NaCl, 10 мМ EDTA, 10 мг / мл lysozyme) өсгөвөрлөнө. Дараа нь 37 0 С-т 30 минут өсгөвөрлөнө. буфер, эсүүд 12 удаа 30 секунд, 30 секундын завсартай мөсөн дээр sonicated байна UP400St 100% -ийн хүчээр хэт авианы процессор (Hielscher Ultrasonics GmbH). 9000 г-д 10 минутын турш центрифугдэж, supernatant-ийн 800 мкл-ыг -20 ° C-д хадгалав. (Waldminghaus 2010)

Ферментийн хэт боловсруулалт, ариутгал.

Деdatistidine (His10) -тай цусны дарангуйлагдсан бүтээгдэхүүнд E. coli BL21 (DE3) пет19б бүтцийг өөрчилсөн байна. Өглөөний цай идээшлэх ажлыг центрифугээр хурааж, 1% нь илэрхийлэх соёлыг тарихад ашигладаг. PET19mgtB дангаараа явуулсан эсүүд нь 600 нм-ийн оптик нягтралтай хүртэл 22 ° C-д ургаж байв (OD600) 0.7 байна. Соёл нь 17 0С-т шилжиж 100 мкм-ийн IPTG-ээр өдөөгдсөн. 16 цагийн дараа соёл нь 4 0С-т 7,500 х градерт центрифугээр хураана. Сийвэн дэх эсүүд нь 50 мМ фосфат-буфержуулсан давсны уусмал (PBS) 0.3 М NaCl-р рН 7.4-т буцааж, S2 micro-tip sonotrode бүхий ultrasonication -ээр тасалдсан. UP200St ultrasonicator (Hielscher, Teltow, Germany) 0.5 цикл болон 75% -ийн далайцтай.
Decatistidine-ийн шошго бүхий GtfC-г хэт их үйлдвэрлэхэд ОӨ-ийн температурт 37 0С-д хүргэдэг600 нь 100 мкм-ийн IPTG байна. MgtB-д зориулж 4 цаг өсгөвөрлөн, хураан авсан ба лисэнд өсгөвөрлөнө.
Түүхий эсийн хандыг 15,000 х гр, 4 ° C-д центрифугт, эсийн хог хаягдлыг тунадасжуулж байна. Тодруулагдсан хандыг ÄKTAprime Plus систем (GE Healthcare) ашиглан 1 мл-ийн HisTrap FF Crude баганад суулгасан. Ферментүүд нь түүний-шошготой уурагуудын градиент хэмжилтийг үйлдвэрлэгчийн протоколын дагуу цэвэршүүлсэн. Үлдэгдэл уургийн уусмалыг 1000 мл 50мл PBS, рН 7.4, 0,3 М NaCl-т 4 0С-т 2 удаа хийнэ. Цэвэршүүлэлтийг SDS-PAGE 12% -аар шинжлэв. Уургийн концентрацийг Брюсфорд аргаар Roti-Quant (Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Germany) ашиглан тодорхойлжээ. (Rabausch нар, 2013)

E. coli Bacteria-аас уураг уусгана
Сонирхолтой уургийн уураг (энэ тохиолдолд, Арабидопси Таниазийн MTV1) нь GST-ийн шошгонд нэгдэх ба BL21 Escherichia coli (E. coli) эсүүдээр илэрхийлэгдэнэ.
1. GST-MTV1, GST (50 мл бактерийн өсгөвөрт харгалзах), 2,5 мл-ийн мөстэй хүйтэн хандлах буфер дээр дахин уусгана.
2. Ultrasonicator ашиглана уу UP100H (MS3 microtip-sonotrode) бага хэмжээний эзэлхүүнтэй (2-5мл) тоноглогдсон ба бактерийн эсийг шүүдэслэнэ. Үүнийг мөсөн дээр хийнэ. Үүнийг интервалтайгаар (жишээ нь 10 секундын дараа sonicating, мөсөн дээр 10 секундын дараа) хийхийг зөвлөж байна. Хэт их эрчимээр sonicate хийхгүй байхыг анхаарах хэрэгтэй. Хэрвээ цагаан хөөсөрхөг үүсгэх эсвэл цагаан тунадас үүссэн бол мэдэгдэхүйц багасгах шаардлагатай.
3. Лизжсон нянгийн уусмалыг 1.5 мл микросенфузугийн хуруу шил, центрифугийг 4 0С-т, 16,000 xg-т 20 минутын турш шилжүүлнэ.

E. coli дахь Allicin-modified proteins

VialTweeter нь жижиг түүвэр гомогенжүүлэхэд тав тухтай ultrasonicator юмSulfhydryl-ийн агууламж 5,5'-Дитиибис (2-ниброгенозойны хүчил) (DTNB) -ийг тодорхойлох
E. coli MG1655 шөнийн өсгөвөрийг MOPS-ийн хамгийн бага орчин (1: 100) тарихад хэрэглэсэн. A600-ыг 0.4 хүрэх хүртэл өсгөвөр аэробик ургуулж өссөн. Стресс эмчилгээ хийхэд 15 мл-ийн гурван өсгөвөрт хуваагдана. Эмзэг бус соёл нь сөрөг хяналтыг бий болгосон. 0.79 м.м бүхэлд нь (128 μг мл-1) эсвэл 1ммиидын үлдэгдэл нь үлдсэн хоёр соёлуудын аль нэгэнд нэмсэн. 15 минутын туршид соёолж тариалсан. Соёлын өвчлөлийн 5 мл-ийг центрифугт (8,525 х гр, 4 0С, 10 мин) хураан авдаг. 2 мл PBS (137 мл NaCl, 2.7 мМ КCl, 10 мА Na-ээр хоёр удаа угааж байсан)2HPO4, 2 мм KH2PO4, рН 7.4, хэрэглэхээс өмнө anaerobically хадгалсан), центрифуг (13,000 х, 4 ° C, 10 мин). Хэт авианы аппаратыг 4 ° С-д тасалдаж эхлэхээс өмнө эсийн буфер буфер (PBS бүхий 6 мМ guanidinium HCl, рН 7.4) дээр шингэлсэнVialTweeter ultrasonicator, Hielscher GmbH, Герман) (3 × 1 мин). Хагархайг центрифугээр (13,000 х гр, 4 градус, 15 мин) төвлөрүүлсэн байна. Спиртийг 3.5 мл-ийн QS-макро кювет (10 мм) -ээр соронзон хутгуураар, 1 мл лизисийн буфертай хольсон. Дээжийн ослоос 412 нм-т мониторинг хийж JASCO V-650 спектрофотометрийг PSC-718 температурт хяналттай үүрэнд (Jasco) тоноглож өрөөний температурт хянаж байна. 3 мM dithiobis (2-ниброгенозойн хүчил) -ийн 100μl уусмал нэмсэн. Нөхөнд хүрч дуустал устсан. Тиолитийн концентрацийг тооцохдоо устах коэффициент ε -ийг ашиглана412 = 13,700 М-1 см-1 Ти2-2-ниброзозозын хүчил (TNB). Үр эсгэгчийн концентрацийг 6.7 х 10-ийн E. coli эсийн тоо хэмжээгээр тооцоолсон-15 литрийн болон эсийн нягтрал А600 = 0.5 (1 × 10-тай тэнцүү8 эсийн мл-1 соёл). (Müller нар, 2016)

Виво Глутатионид тодорхойлох

E.coli MG1655 нь хамгийн бага дунд зэргийн тэжээлийг 200 мл хүртэл А хүртэл өсгөвөрлөнө600 0,5 хүрсэн байна. Стресс эмчилгээнд зориулж 50 мл-ийн өсгөвөр болгон хуваасан. 0.79 мМ лиценци, 1мМ амидид, эсвэл диметил сульфоксид (хяналт) -ийг 15 минутын дараа 4 мл 4000С-т 10 минутын турш хурааж авна. KPE буферээс 700μl-ийн үржлийг сэргээхээс өмнө эсийг 2 удаа угаана. Хүч суллахын тулд хэт авианы (3 x 1 мин) эсүүд тасалдаж эхлэхээс өмнө 300л 10% (w / v) сульфосалицилийн хүчил нэмсэн. VialTweeter ultrasonicator). Супержүүлэгч нар центрифуг (30 мин, 13,000г, 4 о С) авсны дараа цуглуулсан. Сульфосалицилын хүчил агууламж 1% -иар буурч KPE буфер 3 боть нэмсэн. Нийт глютатион болон GSSG-ийн хэмжилтийг дээр дурьдсаны дагуу гүйцэтгэсэн. Үүрэн глутатионы концентрацийг 6.7-ын E. coli эсийн тоон дээр тулгуурлан тооцоолов×10-15 литрийн болон эсийн нягтрал А600 0.5 (1-тэй тэнцүү×108 эсийн мл-1 соёл). GSH концентрацийг нийт глутатионоос 2 [GSSG] хасах замаар тооцоолсон. (Müller нар, 2016)

Биологийн материалын эсийн лизис, биологийн материалын олборлолт Хэт автосфератор (Томруулж дарна уу!)

Сорьцын төрөл ultrasonicator UP400St

Хүний mAspатыг E. coli хэлээр илэрхийлнэ

Дотоодын бодисыг (жишээ нь уураг, бие организм, ДНХ, РНХ г.м) олборлосноор Хэт авианы эс тээглүүр UP400St (400W)E. coli BL21 (DE3) -ийн нэг колони вектор илэрхийлэлийг 30 мл Luria-Bertani (LB) орчинд 100μg / мл ампициллин агуулсан орчинд хадгалж, дараа нь 37 оС-т оптикийн нягтрал (OD600) 0.6 хүрчээ. Эдгээр эсийг 4000л граммаар 10 минутын турш центрифугжуулж, 100мг / мл ампициллин агуулдаг 3 L шинэхэн LB орчинд дахин шингэсэн байна.
Дараа нь уургийн илэрхийлэл 1 мм изопропил β-ᴅ-1-thiogalactopyranoside (IPTG) -аар 20 ˚C-т 20 цаг байлгана. Эдгээр эсийг 15 минутын турш 8000 х граммаар центрифугээр хураан аваад A (20 мМ NaH2PO4, 0.5 М NaCl, рН 7.4) бутлуураар угаана. Ойролцоогоор 45 г (нойтон жин) эсийг 3 литрээс авсан. Центрифугдэсний дараа эсийн үрлэн 40 мл (1 литрийн өсгөвөр дээр) мөстэй хүйтэн хандлах буфер дээр дахин сэргээгдэж, мөс хүйтэн температурт ultrasonication UP400St хэрэгсэл (Доктор Hielscher GmbH, Герман). Энэ эсийн уусмал нь 15 минутын турш 12000 минутын турш центрифугдэж уусдаг (тунасан) болон тунадасжсан (пеллет) фракцийг салгах болно. (Jiang нар, 2015)

Доорхи хүснэгтэд манай хэт авианы аппаратуудын ойролцоо хүчин чадлын процессыг харуулж байна:

багц-р боть урсгалын хэмжээ Зөвлөмж болгож буй төхөөрөмжүүд
0.5 - 1.5 мл na VialTweeter
1- 500мл 10-200мл / мин UP100H
10-2000 мл 20 - 400мл / мин Uf200 ः т, UP400St
0.1-20L байна 0.2-4L / мин UIP2000hdT
10-100л 2-10л / мин UIP4000
na 10-100л / мин UIP16000
na том нь кластер UIP16000

Холбоо барих! / АНУ-ын асуу!

Та хэт авианы нэгэн төрлийн талаар нэмэлт мэдээлэл шаардах хүсвэл доорх маягтыг ашиглана уу. Бид танд таны хайсан үгийн хангасан нь хэт авианы системийг санал болгож баяртай байх болно.









Биднийг анхаарна уу Нууцлалын бодлого.


Уран зохиол / Ашигласан материал



Баримтууд үнэ мэдэх

E.coli

Escherichia coli (E. coli) нь цусан дахь организмын доод булчирхай (endotherms) гэдэсний гэдэсний доод хэсэгт түгээмэл байдаг Escherichia төрлийн гран-сөрөг, anaerobic, титэм хэлбэртэй, coliform бактери юм. Олон янзын шинж чанартай E. coli олон тооны омог (эсвэл дэд хэвшинж) байдаг. Ихэнх E. coli омгууд нь хүмүүст хоргүй байдаг. Жишээлбэл, B, K-12 төрлийн лабораториудад судалгааны зориулалтаар ашиглагддаг. Гэсэн хэдий ч зарим омог хортой бөгөөд хүнд өвчин үүсгэдэг.
E. coli нь орчин үеийн биологийн инженерчлэл, үйлдвэрлэлийн микробиологийн хувьд чухал үүрэг гүйцэтгэдэг. Ихэнх лабораторийн хэрэглээ нь ихэвчлэн E. coli ашиглах, тухайлбал, рекомбинант деоксирбонуклений хүчил (ДНХ) үүсгэх эсвэл загвар организмын үүрэг гүйцэтгэх.
E. coli нь гетерологит уургуудыг үйлдвэрлэх маш олон талын хост бөгөөд E. coli-д рекомбинант уураг үүсгэх олон төрлийн уургийн экспрессийн системүүд байдаг. Уурагыг өндөр түвшинд илэрхийлэх плазмидыг ашиглан генүүд нь бактериудад нэвтрэн ордог бөгөөд энэ нь үйлдвэрлэлийн исгэх процесст ийм төрлийн уургыг их хэмжээгээр үйлдвэрлэх боломж олгодог.
E.coli нь инсулин үүсгэх эсийн үйлдвэрүүдэд ашиглагддаг. Цаашлаад вакцин, хөдөлгөөнгүй ферментүүдийг боловсруулж, үйлдвэрлэх, био түлш үйлдвэрлэх, био-эмчилгээнд зориулж өөрчилсөн E. coli эсийг ашиглана.
K-12 омог нь ферментийн шүлтлэг фосфатаза (ALP) -ийг хэт их илэрхийлдэг E. coli хэлбэрийн мутац юм. Энэ мутац нь ферментийг байнга кодлох генийн согогоос шалтгаална. Хэрэв ген нь ямар нэгэн саадгүйгээр бүтээгдэхүүн үйлдвэрлэж байвал үүнийг үндсэн үйл ажиллагаа гэж нэрлэдэг. Энэхүү тусгай мутант нь ALP ферментийг тусгаарлах, цэвэршүүлэхэд хэрэглэгддэг.

Хэт авианы ДНХ хяргах

Хэт авианы зүсэмийн хүч нь эсээс тусгаарлах, ДНХ-ийн хэсгүүдийг салгаж авахад түгээмэл хэрэглэгддэг арга юм. Акустик х ндий нь эсийн хана, мембраныг эсийн доторх ДНХ-ийг задлах, 600 орчим фрагментийг үүсгэдэг – Урт нь 800 хос суурь, шинжилгээний хувьд тохиромжтой.
ДНХ-ийн хуваагдал нь хэт авианы нэгэн төрлийн болгодог талаар энд дарж энд дарна уу!