Hielscher Хэт авианы технологи

Баруун Blotting-ийн хувьд хэт авианы Lysis

  • Баруун бүслүүр нь homogenate буюу эсийн дээжийн дээжинд тодорхой уургийг илрүүлэх шинжилгээний арга юм.
  • Баруун бета эсвэл ферментийн үйл ажиллагааг хэмжихийн тулд олон сорьц нь эсэд наалддаг материалууд (жишээ нь уураг, ДНХ, эсийн хэсэг) нэвтрэхийг шаарддаг.
  • Sonication нь хяналттай эсийн тасалдал, лизентэд найдвартай, хялбар ажиллах арга юм.

Хэт авианы эсийн хомсдол

Материал, соёлжсон эсээс уургийн олборлолт нь биологийн, биохими, аналитик арга (PAGE, Western blotting, ELISA, масс спектрометрийн гэх мэт), эсвэл уураг цэвэршүүлэх анхны алхам юм. Өндөр уургийн гарцыг олж авахын тулд эсийн материал болон эдийг үр дүнтэй тасалдуулж / лизедэртэй байх ёстой. Ургамлын эс, амьтны эд эсийн аль нь ч бай, sonication нь эсийн лизатыг хялбар, хурдан бэлтгэх арга юм.

Sonication-ийн давуу тал

  • хурдан & үр ашигтай
  • Easy үйл ажиллагаа
  • уургийн гарц өндөр
  • дахин боловсруулсан / давтагдах боломжтой
  • нарийн хяналттай
  • өргөтгөх боломжтой

Баруун Immunoblotting-ийн дархлаа сулруулах протокол

A. Урвалж

Уусмалыг бэлтгэхдээ Milli-Q зэрэг цэвэршүүлсэн усыг хэрэглэнэ.

  • 1X фосфатын буфертай давс (PBS)
  • 1мл Трисс (pH 7.5), 150мм NaCl, 1мМ трилон, 1мм EGTA, 1% Triton X-100, 2.5 мм Натри пирофосфат, 1мм β-глицерофосфат, 1мМ Na3VO4, 1мкг / Leupeptin
    Чухал: Хэрэглэхийн өмнө 1мм-н PMSF нэмнэ.
  • 15 мкл Уургийн A + 15 мкл Уураг G нь IP-д хангалттай боловч танай антибиотик ба дээжийн эзлэхүүнээс хамаарч болно. Урьдчилан холимог уураг A / G agarose (жишээлбэл, туулайн IgG доош уураг А уураг А, доош нь хулганын IgG доош Protein G)
  • 3X SDS Дээжийн буфер: 187.5мм Трис-HCl (pH 6.8 at 25 ° C), 6% w / v SDS, 30% глицерол, 150мM DTT, 0.03% w / v бромфенол хөх
Hielscher's VialTweeter is is´deal for the lysis of multiple samples

VialTweeter хэт авианы дээж бэлтгэх

Холбоо барих! / АНУ-ын асуу!





Биднийг анхаарна уу Нууцлалын бодлого.


Дээжлэлт хийх үед sonication бол чухал алхам юм

UP200St нь дээж sonication нь микро-орой нь

B. Cell Lysates бэлдэх

  • Хадгалалт хий. Нүцгэн нөхцөлд байлгахын тулд эсийг ургац хураахын тулд медианы хүйтэн PBS ашиглан медиа устгана.
  • PBS-ыг аваад 0.5 мл-ийн хүйтэн мөсөн 1X лизенцийг буфер бүрт (10см) болгон тавин 5 минут тавина.
  • Махыг ялтсаас ялгах ба микротерентрифуны хоолойд шилжүүлнэ. Мөсөн дээр бай.
  • Хоѐр удаа секундэд 10 секундын турш мөсөн хүйтэн дархлаа сэргээгдэх орчны буфер (IP буфер: 50 мг Трис-HCl [рН 7.4], 150мм NaCl, 5мМ Трилон, 0.1% NP-40, протеазын дарангуйлагч хольц). Sonication нь VialTweeter Жишээ нь шалгалт, хэт авианы UP100H эсвэл Uf200 ः т хамгийн тохиромжтой.
  • Лосатыг 15000 гр-д 4 минутанд 10 минутын турш центрифугенжүүлнэ.
  • Шинэхэн хоолойг шинэ хоолой руу шилжүүлнэ. (Хэрэв шаардлагатай бол lysate -80 ° C-д хадгалж болно.)
  • Үндсэн эсрэгбиеийг туйлын өмнө нэмнэ. Анхдагч эсрэгбиеийн туйлын тунадсыг 4 0С-т 1 цаг өсгөвөрлөнө. Анхны эсрэгбие нь ихэвчлэн баруун бүслүүрт хэрэглэхээс 10 дахин их концентрацитай байдаг. (Та 100μg тутамд 1μg-ээс эхлэх боломжтой).
  • Дараа нь ид шидийг нэг уураг А-агарегат (Урвалын азот), Protein G agarose-ээр 1 цаг өсгөвөрлөнө.
  • IP буферийн тусламжтайгаар агарусын үрлэнг 3 удаа угаах. Дараа нь уургийг SDS-PAGE буферийг 95 ° С-т халааж 5 минутын турш халаана.

В. Урьдчилан сэргийлэх хуримтлал

  • 200 мкл эс лиатыг аваад анхдагч эсрэгбиемийг нэмнэ. 4 ° С-т шөнийн зөөлөн эргэлт хийж инкубаторлоорой.
  • А буюу G агарусын уураг (20 мкл 50% -ийн ирмэгийн хольц) нэмнэ. 4 ° С-т 1-3 цагт зөөлөн эргэлт хийнэ.
  • Микрокрентрифуг нь 30 секундын турш 4 о С-тэй. 500 мкл-ийн 1Х эсийн лизер буфераар 5 удаа угаана. Угаах үед мөсөнд байлгана.
  • 20 мкл 3Х SDS дээжийн буфер ашиглан үрэлийг буцааж болгоно. Vortex, дараа нь 30 секундын microcentrifuge.
  • Дээжийг 95-100 0С-т 2-5 минутын турш халааж, микрокрентрифуг 1 минутанд 14000 X г-д хийж халаана.
  • Дээжийг (15-30 μл) SDS-PAGE гель (12-15%) дээр ачааллана.
  • Баруун бүслүүрээр дээжийг шинжлэ.

Дэлгэрэнгүй мэдээллийг Холбоо барих / асуу

Таны боловсруулах шаардлагын талаар бидэнтэй ярилц. Бид таны төслийн хамгийн тохиромжтой тохиргоог, боловсруулах параметрүүдийг санал болгож болно.





Биднийг анхаарна уу Нууцлалын бодлого.


Дэлгэрэнгүй Sonication Protocols

Ultrasonicator UP50H нь Баруун Blot шинжилгээ

Kriebisch et al-ийн судалгаанд дараах протоколыг ашигласан болно. (2011):
Нийт уураг нь MCA-3-E1 эсээс 1,25 (OH)2D3 (10-8 M) буюу тээврийн хэрэгсэл. Селенууд нь 50 мг Трис HCl, рН 8 (Sigma-Aldrich) агуулсан буфертай лицензтэй байна. 150 мл NaCl (Фишерын эрдэмтэн); 0.1% натри додецил сульфат (SDS) (Фишерын шинжлэх ухаан); 1% IGEPAL CA-630 (Sigma-Aldrich) ба 0.5% натрийн deoxycholate (Merck). Эсийн лизатыг мөчлөгийн 1 ба далайцтай 80 үед 2 × 10 секундад sonicated хийсэн UP50H Хэт авианы процессор (Hielscher, Ultrasound Technology, Teltow, Герман). Үүний дараагаар материалыг 14000 минутын хугацаанд 10 минутын турш центрфустенжүүлсэн ба баруун талыг задлахад хэрэглэдэг supernatant. Хорин таван μг уургийг дээж буферд хийж буцалгах (Invitrogen) агентыг дараа нь дараа нь SDS-PAGE 4-12% polyacrylamide gel (Invitrogen) ашиглан нитроцеллюлоз мембранд (GE эрүүл мэндийн үйлчилгээ) шилжүүлсэн. Мембраныг 1 цагийн турш TBS (10 мг Трис-HCl, pH 7.6, 150 мМ NaCl) 1 цаг хааж, 1% казеин (Sigma-Aldrich), 1% Трис (1 М) агуулдаг. Битүүмжилсэний дараа мембраныг шөнийн 4 ° С-т шөнийн цагаар антибиотикоор (антибиотик антибиотик туулайтай антибиотикаар тарьсан), антибиотик эмчилгээг хийсэн. Тунгалаг пероксидид (HPR) -тай инкубацлах хоёрдогч эсрэгбием (Dako) -ийг тасалгааны температурт 1 цаг байлгана. Бүх самрыг сайжруулсан химилуминсенцэр (Perkin Elmer) боловсруулсан.

Уран зохиол / Ашигласан материал



Баруун Блоттингийн тухай

Бүрхүүл нь ДНХ, РНХ ба уургууд нь зөөгч рүү шилжих боломжтой аналитик процедур юм.
Өмнөд бүслүүрийг ДНХ илрүүлэхэд ашиглах, РНХ-ийн Хойд Blot болон уургийн хувьд баруун бүслүүрийг ашигладаг.
Баруун бүслүүрийг мөн уургийн immunoblotting гэж нэрлэдэг ба эсрэгбие нь эсрэгтөрөгчийг тусгайлан илрүүлэхэд хэрэглэдэг. Баруун Блоттинг нь дээжинд тодорхой уураг илрүүлэх хамгийн чухал шинжилгээний нэг арга юм. Баруун бүсийн хувьд уургууд нь моноклилон буюу пикикликалийн эсрэгбиемүүдийг ашиглан мембранд идэвхгүй болгодог.
SDS-полаэкриламид гель электрофорез (SDS-PAGE) нь перецептидийн уртын дагуу 3-D бүтэц эсвэл денатурацийн уургаар тусгаарлагдсан байдаг. Уургууд нь дараа нь мембран (ихэвчлэн нитроцеллюлоз буюу PVDF) руу шилжинэ. Тэдгээр нь зорилтот уурагтай тусгай эсрэгбиемүүдээр будсан байдаг. Гель электрофорезын алхам нь эсрэгбиеийн хөндлөнгийн урвалын асуудлыг шийдвэрлэхийн тулд барууны бүсийн шинжилгээнд ордог.
Дараа нь тусгаарлагдсан уургууд нь матриц дээр (ихэнхдээ нитроцеллюлоз эсвэл PVDF мембран дээр) арилдаг бөгөөд тэдгээр нь эсрэг биетүүдээр будсан байдаг. Эсрэгбиемүүд нь шалгаж, зорилтот уурагт тусгайлан сонгогддог. Тодорхой урвалын байршил, эрчимжилтийн дүн шинжилгээнд өгөгдсөн дээжинд зорилтот уургын нарийвчилсан тайлбарыг үзүүлнэ. Баруун бүслүүр нь гель электрофорезын өндөр нарийвчлалтай, хүчтэй өвөрмөц чанар, дархлааны өвөрмөц мэдрэмтгий чанараас шалтгаалан 1г-ээс бага хэмжээтэй зорилтот уургийг илрүүлж чаддаг. Барууны бүдгэрүүлэх арга нь молекул биологи, биохими, иммуногенетик болон бусад молекулын судалгааны талбарт ашиглагддаг.
Бусад холбогдох аргууд нь иммуногистохими ба иммуноктохими организмууд, эсүүд дархлаажуулалт, ферменттэй холбоотой иммунозрорбины сорил (ELISA) зэргийг илрүүлэхэд эсрэгбиемүүдийг ашиглана.