Hielscher Хэт авианы технологи

Хэт авианы ДНХ хяргах

  • ДНХ, РНХ хяргах үед ДНХ-ийн молекулууд нь жижиг хэсгүүдэд хуваагдана. ДНХ / РНХ-ийн хуваагдал нь дараагийн үеийн дарааллын (NGS) номын санг үүсгэхэд чухал дээж бэлтгэх алхмуудын нэг юм.
  • Хэт авианы ДНХ хяргах нь ДНХ, РНХ-ийг 100 ширхэг болгон хуваах акустик х ндий хүчийг ашигладаг – 5kb Бp.
  • Хэт авианы хяргалт нь ДНХ-ийн нарийн хэсэгчилсэн хуваагдал ба хүссэн ДНХ-ийн уртад дасан зохицох боломжийг олгодог.

Хэт авианы ДНХ хяргах

Hielscher Ultrasonics нь ДНХ, РНХ болон хроматин хясаагаар янз бүрийн хэт авиан шинжилгээнд суурилсан шийдлийг санал болгодог. Микротип ашиглан шууд sonication ашиглан датчик төрлийн ultrasonicators (жишээлбэл, UP100H), эсвэл VialTweeeter эсвэл хэт авианы cuphorn ашиглах нь янз бүрийн дээж шууд бус ДНХ бэлтгэх нь сонгох. Hielscher таны хэрэгцээг харгалзан хамгийн тохиромжтой төхөөрөмжийг санал болгодог: танд 1 эсвэл 10 хүртэлх дээж, микролитоос их хэмжээгээр литрийн хэмжээ – Hielscher хэт авианы процессорууд нь ДНХ, РНХ болон хроматины фракцуудыг зөв уртад бэлтгэхийн тулд таны шаардлагыг хангах боломжтой. Давтамж, хялбар ажиллагаа, нарийвчилсан хяналт нь дараагийн үеийн дарааллын найдвартай номын санг бий болгодог.
Ферментийн ДНХ-ийн хуваагдалаас ялгаатай нь хэт авианы хяралт нь ямар ч химийн бодис үүсгэхгүйгээр цэвэр механик зүслэгийн хүчийг хэрэглэдэг. Процессийн параметрүүдийг нарийвчлан тогтоож, хэт авианы хяралт нь өндөр молекул жин ДНХ-ийн хэсгүүд (плазмид ба геномын ДНХ) үүсгэдэг.
Цэвэршүүлсэн нуклакийн хүчлүүд нь хуваагдах үеэс өмнө буюу хойно олширч болно.
Sonication параметрүүд (цахилгаан, импульсийн цикл / дагуулдаг, цаг хугацаа, температур) програм хангамжийн тохиргооноос аюулгүйгээр хянаж болно.

Давуу талууд:

  • нарийн хяналт
  • Sonication цикл, цаг хугацааг яг тохирох ДНХ-ийн хэмжээтэй тохируулах боломжтой
  • өндөр молекул жин ДНХ-ийн хэсгүүд
  • температурын хяналт
  • хурдан
  • дахин боловсруулсан үр дүн
  • автоклавт
  • олон янзын шийдлүүд: Сорилын төрөл, VialTweeter болон Cuphorn

Хэт авианы ДНХ хяргах протокол

Chromatine immunoprecipitation-ийн шинжилгээний зорилгоор

Товчхондоо эсүүд нь 60 мм диаметртэй таваг (нэг хоолны таваг 400,000), RhoA siRNA-т шилжих (тайлбарласнаар); 72 цагийн дараа 37 ° C-д 10 минутын турш формальдегид (эцсийн концентраци, 1%) өсгөвөрлөнө. Үүнд: 1.25 моль / л-ийн гликин аравны нэмж, 125 ммоль / л-ийн эцсийн концентрацийг нэмсэн. Үрийг 2 удаа угааж, 150 ммоль / л NaCl, 1% NP40, 0.5% deoxycholate, 0.1% SDS, 5 ммоль / L EDTA, 50 ммоль / L Tris-HCl (pH 8.0 ) 1 ммоль / л фенитметилсульфонил фторид, 1мг / мл алкатинин, 1мг / мл литрататин А, 30 минутын турш мөс хадгална. Дараа нь cell lysates нь мөсөн дээр sonicated байна Hielscher UP200S Хэт авианы Sonicator (3 x 40 с, далайц 40%, мөчлөгийн 1, Hielscher Ultrasonics GmbH) хоорондын холбоо бүхий хроматинууд нь ДНХ-ийн фрагментийг 200-аас 1,000 хооронд гаргах боломжтой болгодог. Өөр өөр дээжинд ДНХ-ийн хэмжээг тоогоор тооцохын тулд бүх лисатын аравны нэгийг ашиглана “нийт оролтын ДНХ”. Супермаркетууд нь өвөрмөц бус өвөрмөц байдлыг багасгахын тулд хулд үрийн шингэний ДНХ / уураг агарус-50% -ийн наранцэцэгээр өсгөвөрлөнө. Дараа нь Immunoprecipitation-ийг 4 0С-т шөнийн туршид NF-nB p65 (Upstate) эсрэг эсвэл эсрэгбиеийн эсрэг (эсрэг сөрөг хяналт) 5С-т шөнийн дотор хийж гүйцэтгэнэ. Эдгээр шингэнүүдийг 5 моль / л NaCl -аар баяжуулж, уураг-ДНХ-ийн хөндлөн холбоосыг буцаахын тулд 65 ° C-д шөнө халаана. Дархлалын олдмол хомсдолыг DNase-, RNase-free proteinase K, ДНХ-ийг фенол / хлороформын хандлалт болон этанолын тунадасаар цэвэрлэв. ПГУ-ыг хүний ​​iNOS генийн промоутэрийн бүсэд дараалалд тохирсон тусгай праймеруудыг хийсэн (p1 праймер: 5¶-GAGGGCTTTCCCA-GAACCAAG-3¶; p2 праймер: GCTGGGCTACTGACCCAG-CAGTTCCAG-3¶). (Doublier нар, 2008)

EGFP-илэрхийлэлийн судалгаа

Экспромбины судалгаагаар EGFP (Enhanced Green Fluorescent Protein) хэмээх гентэй хамт ребромбинант омог болох L. tarentolae p10 :: F9Begfp1.4dBsat # 12 (Jena Bioscience, Герман) өмнө нь дурьдсанчлан янз бүрийн хэвлэл мэдээллийн хэрэгслээр тариалсан. Мөн 100 мг л агуулагддаг-1 Nourseothricin (Jena Bioscience, Germany). Тариалалтын явцад 1 мл дээж авна. (2000 × g, 20 ° C, 10 мин), 0,9% NaCl уусмалаар угаана. Пеллет буферд (20 мм HEPES, 5 ми трилон, 2 м.км ДТТ) сэргээгдсэн ба хэт авианы процессортой sonip UP400S (400 Вт эрчим хүчний хэрэглээ). Сэлбэх бодисыг центрифуг (6000 х г, 4 ° C, 5 мин) центрифуг (6000 х г, 4 ° C, 5 мин) арилгаж, Laemmli (1970) -ийн аргаар бууруулсан натрийн додекил сульфат-полаприламид гель электрофорез (SDS-PAGE) . EGFP-ийн илэрхийлэлийг шуурхай соёлоор шалгасан. (Fritsche нар, 2007)

Hielscher's UP100H was used to prepare EHEC DNA for chip array analysis

E. coli EDL933-ийн геномын ДНХ-ийн электрофорезийн шинжилгээнүүд 0-15 минутын хэт авианы хэрэглээтэй. L нь ДНХ шат. (Basselet нар, 2008)

Мэдээллийн хүсэлт




Бидний анхаарна уу Нууцлалын бодлого.


Chromatic immunoprecipitation

Хэт авианы эсийн тээглүүр UP100H (100W) лизис, эсийн тасалдал, ДНХ хяргах.Chromatin immunoprecipitation хурдыг Chip-IT ашиглан хийсэнТМ Express (Active Motif, Carlsbad, CA, USA) үйлдвэрлэгчийн зааврын дагуу зарим өөрчлөлтүүдтэй. Тодруулбал, ялгаатай хүний ​​полимер нь тасалгааны температурт 10 минутын туршид 1% формальдегидтай холбоотой байв. Мөөгөнцрийн PBS бүхий эсүүд угааж, тасалгааны температурт 0.125 М глицинийг 5 минутын турш нэмсэн. Мөөгийг хүйтэн мөсөн PBS-аар угаана. Селенийг центрифугээр буулгаж, лизентын буфер дээр дахин шингээсэн байна. Центрифугжилсны дараа 30 минутын турш мөсөн дээр инкубацлах буфер буферруу ухаж, хроматиныг sonication-аар үржүүлсэн байна. UP100H (Hielscher Ultrasonics GmbH, Teltow, Germany) 25% -ийг 5 мөч дээр 20 секунд тутамд 200 секунд тутамд ойролцоогоор 200-600 хос суурь болгон хувааж болно. Цахиурын хроматиныг центрифугт хийж, тунг нь цуглуулсан. 60 мкл хроматиныг 1мкл С1 (инкубатор, Santa Cruz биотехнологи, Санта Круз, АНУ), NF-κB p65 (Abcam, Их Британи) эсвэл NF-bB p50 (Abcam) эсрэгбием эсвэл туулай IgG (Zymed Laboratories, Өмнөд Сан Франциско, CA, USA) нь сөрөг хяналтыг 4 ° C-д шөнийн зөөлөн эргэлт хийж өгдөг. Соронзон судалтай холбоотой иммугофоскопууд соронзон байршлаар, их хэмжээгээр угааж, уураг / ДНХ-ийн хөндлөн холбоосыг буцааж, бодит хугацааны ПГУ-ын шинжилгээнд зориулж ДНХ багасгасан. (Ristola нар, 2009)

ЧШ-ийн шинжилгээ хийхэд EHEC ДНХ-ийн бэлтгэл

ДНХ-ийг олборлож, эсийн лийзний зохион байгуулалт
Өгөгдсөн эцсийн концентрацид PBS-д хадгалж байсан нянгийн үрэлийг эмчилсэн хэт авиан ороомог UP100H (Hielscher GmbH, Герман) микротип MS1 (диаметр 1мм). Үйл ажиллагааны давтамж нь 30 кГц ба үр дүнтэй гаралтын хүчин чадал 100 В байв. Үйл ажиллагааны туршид дээжийг мөс усан банн, холимог болон центрифугэрт хөргөнө. Дээжийг цитометр шинжилгээнд хэрэглэж байсан бол дараа нь дээжийг дулааны боловсруулалтанд (95 ° C, 5 мин) хамруулсан. Үндсэн эсийн лийзийг фенолын холимогоор боловсруулсан: хлороформ: изоил спир (25: 24: 1). Энэ хольцын ижил эзлэхүүнийг лизатын дээжинд нэмж, 15 секундын турш 15 секундын турш идэвхжүүлсэн уусмалыг 22 0С-ийн температурт (RT) тасалгааны температурт 2 минутын турш хатаана. Геномын ДНХ агуулсан дээд усан фазыг болгоомжтой салгаж, Eppendorf хоолойн шинэ саванд цуглуулсан.
Дараа нь ДНХ-г хуваахын тулд дээжийг sonicated хийсэн. Sonication алхам дээр дээр дурдсантай ижил нөхцлөөр биелсэн. Геномын ДНХ-ийн ялгах нөлөөг үнэлэхийн тулд дээжийг агарын гел электрофорез ашиглан шинжлэв.
(…) Өмнө нь 2.5 минутын турш дээжийг дулааны боловсруулалт, центрифугийн дараа олборлолтонд оруулав. ДНХ-ийг 2 удаа фенолоор гаргаж авсан. Хлороформ: изоил спиртийн холимог, дараа нь 2-оос 15 минутын турш sonication хийнэ. Агароз гел электрофорезыг ашигласан хэт авианы таслалтын дараа ДНХ-ийн тархалтын хэмжээг тодорхойлоход хэрэглэсэн (Зураг дээр баруун дээд талд). Маш их хуваагдмал ДНХ нь өндөр молекул жинтэй туузаас илүү ДНХ-ийн троз үүсэхээс илэрч, 2.5 минутын туршид sonicated дээжээс хасагдсан. Урт хугацааны sonication нь фрагментийн уртыг ойролцоогоор 150-600 хос суурь болгон бууруулж, 15 минутын sonication нь илүү их хэмжээгээр доройтсон эдгээр т рхэцийг т рхэцийн дээд хэсэгт харагддаг. Тиймээс ДНХ-ийн фрагментийн дундаж хэмжээ аажмаар хэт авианы хугацаатай буурч, 5 минутын эмчилгээ нь чип массив сорьцонд хамгийн тохиромжтой ДНХ-ийн фрагментийг олж авахыг зөвшөөрдөг. Эцэст нь хэт авианы эмчилгээний эхний 2 мин, ДНХ-ийн олборлолт (2 ×), дараа нь 5 минутын sonication үүссэн ДНХ-ийн анализ хийх бэлтгэл ажиллагаа хийгдсэн. (Basselet нар, 2008)

Chromatic immunofrecipitation (Chip)

Хэт авианы процессор UP100H ДНХ, РНХ болон хроматин хяргадаг. (Томруулах дарна уу!)HEK293 эс дээр дээр дурдсанчлан өсгөвөрлөн, өрөөний температурт 2мм дисуccинимидил-глутаматаар хатаана. Дараа нь эсүүд нь 2 удаа угааж байсан. Хроматин тасалгааны температурт 10 минутын турш 1% (v / v) формальдегидыг хэрэглэж, мөс хүйтэн PBS бүхий хоёр удаа угаана. Холболтын хариу урвалыг тасалгааны температурт 5 минутын турш 0.125 М-тэй сүүлийн үеийн агууламжтай гликинээр инкубацаар зогсооно. Трипсинтэй инкубацийн дараа эсүүдийг эсийн өсгөвөрлөөс хутган, PBS-ээр хоёр удаа угаана. Хоолны үрэл нь лизенцийн буфер (5мм хоолой, рН 8.0, 85мM KCl, 0.5% (v / v) Nonidet P-40), 10 минутын турш мөсөн дээр өсгөвөрлөж, Дунцын нэгэн төрлийн болгогч нэгэн төрлийн болгоно. Дараа нь цөмийг центрифуг (3500 xg, 5 мин, 4 ° C) -аар үржүүлсэн ба бөөмийн буфер (50мм Трис-HCl, pH 8.1, 10мМ Трилон, 1% (w / v) SDS) дээр дахин шингэсэн байна. Нюкли нь sonication-ээр sonication-ээр гурван 20-puls нь a UP50H sonicator (Hielscher Ultraschall Technologie) нь 0,5 болон далайцтай 30% -ийг тогтоож, 200-100 хос суурьтай геномын ДНХ-ийн фрагментийг гаргаж авдаг. Chip-ийн хувьд 50 г ДНХ-ийг дархлаа сэргээгдэх хуримтлалаар 4 дахин өсгөвөрлөнө (16.7 мг Трис-HCl, рН 8.1, 167 мм NaCl, 1.2 мМ Трилон, 1.1% (v / v) Triton X-100, v) SDS). (Weiske нар, 2006)

Хроматин дархлааны химийн шинжилгээгээр гистоны өөрчлөлтийг шинжлэх (Chip)

Товчхондоо, 6 x 106 эсүүд нь PBS-ээр хоёр удаа угааж, өрөөний температурт 15 минутын турш өсгөвөрлөнө. Завсрын холбоосыг 0.125 М гликин нэмсэнээр зогсоосон. Дараагийн бүх алхмыг 48 0 С-д гүйцэтгэсэн. Бүх буфферийг урьдчилан хөргөсөн бөгөөд протеазын дарангуйлагчид агуулдаг байсан (Мини, Рошений бүрэн гүйцэд). Үүргэвчийг PBS-ээр хоёр удаа угаана. Цуглуулсан үрлэнгуудыг 1 мл аликвотын буфер (1% SDS, 5мМ трилон, 50 мМ Tris pH 8) -д уусгаж, 100% -ийн далайцтай 10 мөчлөгт зориулсан хүйтэн этанолоор угаана. UP50H sonicator (Hielscher, Teltow, Герман). Хроматины фрагментацийг 1% агарозын гель байдлаар дүрслэв. Материаг 200-500 pb хэмжээтэй байсан. Хлоратины уусмалыг 48 0С-т 10 минутын турш 14000г-ийн нарийвчлалтай дээжин дээр нь центрифугээр гаргаж авдаг. Шингэрүүлсэн уусмалыг шингэрүүлэгч буфер 1/10 шингэлсэн (1% Triton X-100, 2 мМ Трилон, 20 мг Трис рН 8, 150 мг NaCl) -ийг шингэлж, 80 ° С-д хэрэглэх хүртэл хадгална. (Rodriguez нар, 2008)

Төхөөрөмж Эрчим хүч [W] Төрөл Эзлэхүүн [мл]
VialTweeter 200 дангаараа 0.5 1.5
UP50H 50 гар эсвэл хугарсан 0.01 250
UP100H 100 гар эсвэл хугарсан 0.01 500
Uf200 ः т 200 гар эсвэл хугарсан 0.1 1000
UP200St 200 зогссон 0.1 1000
UP400St 400 зогссон 5.0 2000
Cuphorn 200 CupHorn, sonoreactor 10 200
GDmini2 200 бохирдол, чөлөөт урсгал эсийн

Мэдээллийн хүсэлт




Бидний анхаарна уу Нууцлалын бодлого.


Hielscher's VialTweeter is is´deal for the simultaneous preparation of multiple samples

VialTweeter хэт авианы дээж бэлтгэх

Холбоо барих! / АНУ-ын асуу!

Нэмэлт мэдээллийг асуу

Та хэт авианы нэгэн төрлийн талаар нэмэлт мэдээлэл шаардах хүсвэл доорх маягтыг ашиглана уу. Бид танд таны хайсан үгийн хангасан нь хэт авианы системийг санал болгож баяртай байх болно.









Биднийг анхаарна уу Нууцлалын бодлого.


Уран зохиол / Ашигласан материал

  • Basselet P., Wegrzyn G., Enfors S.-O., Габиг-Киминска М. (2008): ДНХ-ийн чип дээр тулгуурласан шинжилгээний сорьцын боловсруулалтыг enterohemorrhagic Escherichia coli (EHEC). Микробиологийн эсийн үйлдвэрүүд 7:29. 2008.
  • Ховарь С, Риганти Ч., Voena C., Costamagna C., Aldieri E., Pescarmona G., Ghigo D., Bosia A. (008): RhoA нь хүний ​​колони хавдарын эсүүдэд Doxorubicin-ийг эсэргүүцэх чадварыг бууруулдаг. Молекулын хавдрын судалгаа 6 (10), 2008.
  • Мексик, Фридлунд E., Гидлунд A., Оленсон М., Борресч Т., Spliid NHH, Симонссон М. (2008): Миссиси болон улаан буудайгаас Fusarium ДНХ-ийг үнэлэх аргыг үнэлэх ба үүнд урсгалын бодит цаг хугацааны ПГУ-ын тоо хэмжээг тооцоолох ба мекотоксины түвшинд . Микробиологийн аргын сэтгүүл 2008.
  • Fritsche C., Sitz M., Weiland N., Breitling R., Pohl H. -D. (2007): Leishmania tarentolae-ийн єсєлтийн зан їйлийг тодорхойлох - рекомбинант уурагын шинэ илэрхийлэл систем. Үндсэн микробиологийн сэтгүүл, 2007, 384-393.
  • Ристола, Арпиаинен, Сатемма, Матемион PW, Уэльсийн GI, Lehtonen S., Holthöfer H. (2009): Нео3 генийн сигналыг зохицуулах - транскрипцийн хүчин зүйлийн гол үүрэг болох NF-κB ба Sp1. BMC Молекул биологийн 10:83, 2009.
  • Ж. Родригез, Виверс Л., Жорж М., Моралес В., Муноз М., Вендрел Э., Пининадо М. (2008): Түгжигдсэн DNA ДНХ-ийн геномын өргөн хүрээ нь ердийн болон хорт хавдрын эсүүдэд давтагддаг. Nucleic Acids Research Vol. 36, № 3, 2008. 770-784.
  • Weiske J. Huber O. (2006): Гистидин гурвал уургийн оношилгоо1 нь ферментийн үйл ажиллагааны бие даасан апоптозыг өдөөдөг. Биологийн химийн сэтгүүл. Боть. 281, № 37, 2006. 27356-27366.


Баримтууд үнэ мэдэх

Хэт авианы / акустикийн х ндий нь талсжилт, хур тунадасны үйл явцыг дэмждэг өндөр эрчим хүчний хүчнийг бий болгодог (дарна уу!

Хэт авианы ДНХ хяргах нь акустик х ндий, түүний гидродинамик шилжлэг дээр тулгуурладаг