Hielscher ultragarso technologijos

Ultragarso baltymų ekstrahavimas iš audinių ir ląstelių kultūrų

  • Baltymų ekstrahavimas yra esminis proteomikos mėginio paruošimo etapas.
  • Baltymai gali būti ekstrahuojami iš augalų ir gyvūnų audinių, mielių ir mikroorganizmų.
  • Ardymo yra patikimas, efektyvus baltymų ekstrahavimo metodas, suteikiantis daug baltymų derlingumą per trumpą ištraukimo metu.

 

Baltymų ekstrahavimas iš audinių ir ląstelių

Baltymų ekstrahavimas iš audinių ir kultūringas ląstelių yra esminis mėginio paruošimo žingsnis, kuris atliekamas per daugelį biocheminių ir analitinių metodų, tokių kaip ELISA, PAGE, Vakarų blotingo, masių spektrometrija arba baltymų gryninimas. Ultragarso ląstelių sutrikimas, lizė ir ekstrahavimas yra tiksliai valdomas metodas, užtikrinantis didelį baltymų derlių.

Baltymų ekstrahavimas iš gyvūnų audinių

Norint paruošti viso dydžio audinius (pvz., inkstus, širdį, plaučius, raumenis ir kt.), audinys turėtų būti išskaistintas į labai mažus gabaliukus su švarių įrankių, geriau ant ledo ir kuo greičiau išvengti skilimo proteazių (pvz., lizės buferio, pvz., RIPA arba hipotoninis lizės buferis, kuriame yra proteazės ir fosfatazės inhibitoriaus kokteilis. Išpjaustymas, mėginys panardinamas į skysto azoto Snap užšaldyti. Ėminį galima laikyti-80 ° c temperatūroje arba nedelsiant homogenizuoti ant ledo. Prieš pat ultragarso ekstrahavimą į mėgintuvėlį greitai įdedama ledo šalto lizės buferinio tirpalo (su proteazių inhibitoriais DTT, leupeptino ir aprotinino) (per ~ 10 mg audinio maždaug ~ 600 μL buferinio tirpalo). Kiekvienam mėgintuvėlyje rekomenduojama maždaug 20-60mg audinio.
Ultragarso homogenizavimo, lizės ir gavyba yra atliekamas su ultragarso homogenizatorius pvz UP200Ht arba UP200St, įrengta mikro Patarimas sonotrode. Ardymo trukmė yra 60-90 sek. ne ultragarso ciklo režimu 15 sek. ardymo ir 10 sek. poilsio laikas. Mėginys visą laiką turėtų būti laikomas ledu.
Po ultragarso homogenizavimo/ekstrahavimo lizatas maždaug 20 min centrifuguojamas su 27 000 g. po to skystis virš nuosėdų surenkamas taip, kad baltymų koncentraciją galima nustatyti pagal baltymo tyrimą, pvz., Pierce baltymų tyrimo BCA.

Baltymų ardymo yra svarbus metodas mėginio paruošimo

Ultragarso baltymų ekstrahavimas iš ląstelių su UP200St

Informacijos užklausa




Atkreipkite dėmesį į mūsų Privatumo politika.


Baltymų ekstrahavimas iš kraujo serumo

Dėl homogeninio mišinio, serumo ir fosfato buferio, mėginys yra vortexed pirmasis prieš ultragarso ląstelių lizės. Dėl ultragarso lizės, mėginys yra sunaikintos Ultragarsas su ultragarso Lab homogenizatorius pvz UP100H 8 ciklų 20% amplitudę, ciklų kiekvieną 5 sekundes ir 15 sekundžių išjungti. Sonocation atlieka sonicationg ciklų ir pateikdamas mėginio ant ledo, kad perkaitimo ir terminio skilimo mėginio vengiama. Kadangi serume yra daug didelės molekulinės masės baltymų (pvz., albumino, α1-antitripsino, transferino, haptoglobulino, imunoglobulino G ir imunoglobulino A), kurie trukdo atskirti mažos molekulinės masės baltymus per IEF, rekomenduojama juos ardant iš serumo, naudojant išeikvojimo kolonėlę.

Baltymų ekstrahavimas iš augalų audinių

Šviežia, minkštųjų augalų audinių, pvz., Moss ir tt, gali būti lengvai sutrikdomas tiesiog pateikti susmulkintų mėginio medžiagos lizės buferio ardymo. Kietas, ligenous augalų audiniuose, pavyzdžiui, sėklų, eglės adatos ir tt, turėtų būti malti sausas. Kai sunku, sumedėjusių augalų medžiagos turi būti įšaldomi ir žemės skysto azoto prieš ekstrahuojamas ardymo. Augalų ląstelių kultūros suspensijos, Ultragarsinis apdorojimas tarp 30 ir 150 sekundžių lizės buferyje yra daugiausia pakankamas. Sunkiau medžiagos, pavyzdžiui, moliūgų sėklų reikalauja intensyvesnės ardymo, kaip aprašyta žemiau.

Albumino ekstrahavimo iš moliūgų sėklų protokolas

Ultragarsinis audinio homogenizatorius UP400St su S24d40-baltymų ekstrahavimui iš augalų ir gyvūnų audinių (spustelėkite, Norėdami padidinti!)Ultragarso baltymų ekstrahavimo albumino iš bauda-žemės moliūgų sėklų milteliai, 10 g pašalinti riebalai moliūgų sėklų milteliai ir 100 ml dejonizuoto vandens, kaip tirpiklis pridedami 250ml stiklo cheminė stiklinė. Baltymų ekstrahavimas susideda iš dviejų etapų: pirma, mėginys yra sunaikintos Ultragarsas su zondo tipo ultrasonicator UP400St (400W, 24kHz) su sumontuotu sonotrode S24d7. Stiklo cheminė stiklinė dedama į šalto vandens vonią ultragarso homogenizavimo metu. Iš ultrasonicator nustatymas UP400St su Plugable temperatūros jutikliu užtikrinta, kad mėginio temperatūra visada būtų žemesnė kaip 30 ° c. Pagal tikslią temperatūros kontrolę ardymo ultragarsu metu išvengiama albumino denatūravimo. Antra, ekstrahavimas buvo atliktas su maišytuvu esant 200 apsisukimų per minutę greičiui ir 30 ° c temperatūrai. Tada cheminė stiklinė perkeliama į termostatinę purtytą. Naudojant dializę su distiliuotu vandeniu, globulinas pašalinamas. Po globulino pašalinimo iš baltymų ekstrakto galima paimti mėginius albumino profiliui nustatyti ir vėliau koreguojamas pI = 3,0, naudojant 0,1 M HCl albuminui koaguliacija. Kieta fazė atskiriama centrifuguuojant 5000g, 20 ° c temperatūroje ir pakartotinai ištirpinus dejonizuoto vandens vandenyje. Albumino koaguliacija atliekama du kartus, siekiant padidinti baltymų santykį albumino koncentrato.

Ultragarso šarminės baltymų ekstrahavimas baltymų koncentrato paruošimui iš ryžių sėlenų rodo, kad ultragarso apdorojimas sukelia didesnį baltymų derlingumą žymiai trumpesniu ekstrahavimo laiku – lyginant su tradiciniais gavybos metodais.

Ultragarso prietaisas VialTweeter baltymų ekstrahavimas iš audinių mėginiai (paspauskite, Norėdami padidinti!)

VialTweeter netiesioginio ardymo.

Privalumai

  • Greitai
  • didelis derlingumas
  • labai efektyvus
  • Tikslus parametrų valdymas
  • Atkuriamas rezultatas
  • Linijinis mastelio lygis

Funkcinio amino fermento mėginio paruošimo protokolas

Norint gauti visiškai funkcionalų iNOS fermentą (pvz., vaistų atrankai), rekomenduojamas Šis protokolas: ląstelių suspensija turi būti padėta ant ledo ir paveikta UP100H esant 10μm amplitudės ciklo režimu 5 sek. Pašalinkite ir 25 sek. poilsis ant ledo. Procedūra turi būti pakartota apie 3 kartus. Poilsio laikas tarp ardymo ciklų sumažina temperatūros kilimas ir todėl sumažinti denatūravimo riziką.

Ultragarso baltymų Solubilization

Ardymo gali pagreitinti baltymų solubilization procesą, kuris paprastai reikalauja keletą valandų. Kad nebūtų perkaitinti mėginio ir išvengti baltymų skilimo bei tirpalų, kuriuose yra karbamido, ultragarso eilių neturėtų trukti ilgiau nei kelias sekundes.

Bendrosios instrukcijos

Temperatūros kontrolė: Siekiant užtikrinti didelį baltymų kiekį be terminio denatūravimo, turi būti kontroliuojama temperatūra ekstrahavimo metu. Hielscher ' s State-of-Art ultragarso homogenizatoriai – taip pat vadinamas ultragarso Disintegrator arba sonificator – yra tiksliai kontroliuojami. Jie ateina su Plugable temperatūros jutiklis. Į nustatymo galimybes ultragarso homogenizatorius, maksimali temperatūra gali būti nustatyta. Pasiekus maksimalią temperatūrą, ultragarso aparatas automatiškai sustoja, kol mėginys atvėsinamas.
Buferio: Tinkamo buferio pasirinkimo ir dešiniojo tūrio buferio svyruoja nuo audinių ir audinių ir turi būti figured-out bandymų ir klaidų bandymai.
Išskyrimas/valymas: Baltymų lizatai gali būti per daug biomolekulių, pavyzdžiui, DNR ar angliavandenių, kuriuos galima pašalinti baltymų kritulių (dezoksicholato-trichloracto rūgšties) arba buferinių mainų.

Chittapalo ir Noomhorm (2009) pranešė, kad baltymų derlius padidėjo naudojant ardymo ir kad ultragarso audinio homogenizavimo ir lizės procesas gali pagerinti esamus gavybos procesai žymiai – naujų komercinių gavybos galimybių.

Garso apsaugos su Hielscher garso aptvarą SPB-L ir ultragarso prietaisas UP200St. (Paspauskite, Norėdami padidinti!)

Ultragarsinis audinio homogenizatorius UP200St efektyviam baltymų ekstrahavimui

Tiksli kontrolė ultragarso apdorojimo (paspauskite, Norėdami padidinti!)

Naršyklė kontrolė tiksliai veikti ir stebėti ardymo procesas

Ultragarso įranga baltymų gavyba

Hielscher Ultrasonics pasiūlyti platų ultragarso homogenizatoriai ląstelių suskaidymo, audiniai, bakterijos, mikroorganizmai, mielės, ir sporos.
Hielscher Lab ultrasonicators yra galinga ir lengva valdyti. Pastatyta 24/7 operacijos, jie yra suprojektuoti kaip tvirtas ir efektyvus Lab ir talpos įtaisai. Visų prietaisų energijos našumas ir amplitudė gali būti tiksliai kontroliuojami. Įvairūs Priedai atidaro tolesnes sąrankos parinktis. Skaitmeniniai prietaisai, pvz., VialTweeter, UP200Ht, UP200Stir UP400St yra integruota temperatūros kontrolė ir integruota SD kortelė Automatiniam duomenų įrašymui.
Dėl netiesioginės, kryžminio užteršimo ir vienu metu ardymo kelių mėginių, mes siūlome VialTweeter arba Ultragarso CupHorn.
Priklausomai nuo jūsų paraiškos, medžiagos, ir mėginio tūris, mes rekomenduojame jums labiausiai tinka setup jūsų mėginio paruošimo. Susisiekite su mumis šiandien!

Susisiekite su mumis! / Klausk mus!

Jei norite paprašyti papildomos informacijos apie ultragarso homogenizavimą, naudokite žemiau esančią formą. Mums bus malonu pasiūlyti ultragarso sistemą, atitinkančią jūsų reikalavimus.









Atkreipkite dėmesį, kad mūsų Privatumo politika.


Literatūra / Literatūra

  • Chittapalo T, noomhorm a (2009): ultragarso padeda šarminių baltymų gavyba iš pašalinti riebalai ryžių sėlenų ir baltymų koncentratų savybes. Žiniasklaida J maisto Sci Technol 44:1843 – 1849.
  • Simões, André E. S:; Mikas, Diana M.; Amaral, Joana D.; Nunes, Ana F.; Gomes, Sofija E.; , M.; , Adrianas C.; D ' Hooge, rudi; Jautis, Clifford J.; Ir (arba) Borralho, Pedro M.; Rodrigues, Cecília M.P. (2013): veiksmingas baltymų atkūrimas iš kelių šaltinių mėginių po TRIzol arba TRIzol LS RNR išskyrimo ir ilgalaikio saugojimo. BMC genomika 2013, 14:181.


Faktai verta žinoti

Proteomikos

Proteomics yra mokslinių tyrimų srityje, kad tiria baltymus ir proteome. Baltymai fullfil platų gyvybinių funkcijų per organizmų. Proteomas yra visas rinkinys baltymų, išreikštų genomu, ląstele, audiniu ar organizmu tam tikru laiku. Proteomas skiriasi su laiko ir aiškių reikalavimų, arba pabrėžia, kad ląstelės arba organizmas patiria. Tiksliau sakant, tai yra išreikštas baltymų kiekis tam tikro tipo ląstelėje ar organizme tam tikru metu nustatytomis sąlygomis. Terminas yra baltymų ir genomo mišinys. Proteomics yra proteomo tyrimas.

Baltymų

Baltymai yra didelės biomolekulės, vadinamosios makromolekulių – susideda iš vienos ar kelių ilgų amino rūgščių liekanų grandinių. Baltymai yra visuose augalinės ir gyvūninės kilmės organizmuose ir yra labai svarbūs daugumai biologinių funkcijų. Kadangi baltymai turi daug biologinės informacijos, jie ekstrahuojami analitiniu tikslu, pvz., proteominiams tyrimams. Svarbiausia funkcija, atliekama baltymų apima metabolinių reakcijų, DNR replikacija, atsakas į dirgikliams katalizės, ir molekulių vežimas iš vienos vietos į kitą. Baltymai skiriasi viena nuo kitos visų pirma jų seka amino rūgščių, kuris diktavo jų genų nukleotidų seką, ir kuris paprastai sukelia baltymų lankstymo į konkrečią trimatis struktūra, kuri lemia jo aktyvumą. Baltymai yra – Be peptidų – vienas iš pagrindinių maisto komponentų. Todėl proteomikos yra galinga maisto mokslo priemonė, padedanti optimizuoti procesus, maisto saugą ir mitybos įvertinimą.

Gelis elektroforeze

Gelis elektroforezė yra pagrindinis metodas atskyrimo ir analizės makromolekulių, pavyzdžiui, DNR, RNR ir baltymų, taip pat jų fragmentus, remiantis jų dydžiu ir rinkliavą. Jis naudojamas klinikinėje chemijoje atskirti baltymus pagal įkrovos ir/arba dydis (IEF agarozės, iš esmės nepriklausomas nuo dydžio) ir biochemijos, molekulinės biologijos ir proteomikos atskirti mišrios populiacijos DNR ir RNR fragmentai ilgio, įvertinti dydį DNR ir RNR fragmentus arba atskirai atskirti baltymus.

Ląstelių kultūros

Ląstelių kultūra – tai kontroliuojamas auginimo procesas, kurio metu ląstelės auginamos kontroliuojamomis sąlygomis. Kiekvieno langelio tipo ląstelių kultūrų sąlygos skiriasi. Apskritai, ląstelių kultūros aplinka susideda iš tinkamo indo (pvz., Petri lėkštelės) su substratu ar terpe, kuri tiekia esmines maistines medžiagas (amino rūgštis, angliavandenius, vitaminus, mineralus), augimo faktorius, hormonus ir dujas (CO2O2), ir reguliuoja fizis-cheminė aplinka (pH buferis, osmosinis slėgis, temperatūra). Dauguma ląstelių reikia paviršiaus arba dirbtinis substratas, o kitų ląstelių kultūrų, gali būti auginami laisvai plūduriuojančius kultūros terpėje (pakabos kultūra, ląstelių suspensija).
Gyvūnų ląstelių linijų masės kultūros naudojamos pramoninėje virusinių vakcinų ir kitų biotechnologiškai gautų produktų gamyboje. Žmogaus kamieninių ląstelių kultivuojamos išplėsti ląstelių skaičių ir diferencijuoti ląsteles į įvairių somatinių ląstelių tipų transplantacijos tikslais.

Audinių mėginiai

Sąvoka audinių apibūdina korinio tarpinis, kur ląstelių medžiaga yra organizacinio lygio tarp ląstelių ir visiškai organas. Audinių, panašios ląstelės, iš tos pačios kilmės, kad kartu atlikti specialią funkciją, yra surenkamos. Pagal funkcinį kelių audinių grupavimą susidaro sudėtingos organų struktūros.
Iš audinių imami moksliniai tyrimai biologija, histologija/histopathology, parazitologija, biochemija, imunohistochemija, taip pat auginti ir išgauti DNR. Jis gali būti atskirtas nuo gyvūno (poskyris: žinduolis audinio) ir augalų audinių. Gyvūnų audiniai grupuojami į keturias pagrindines jungiamojo, raumens, nervų ir epitelio audinio rūšis. Augalų audinys skirstomas į šias tris audinių sistemas: epidermį, žemės audinį ir vaskulinę audinį.
Audinių mėginiai gali būti ruošiami iš gyvūnų ar augalų dalių, pvz., kaulų, raumenų, lapų ir kt.

Kūno skysčiai

Kraujas, serumas, plazma, smegenų skystyje, seilių ir sinovijos skystis yra kūno skysčiai, kurie siūlo didelį šaltinį diagnostiškai svarbią informaciją. Todėl, sudėtingas paruošimas kūno skysčių mėginius analizei yra svarbus. Pirmasis sunkumas yra susijęs su plataus dinaminio diapazono komponentų, esančių kūno skysčiuose.

Baltymų koncentracijos nustatymas

Bradfordas tyrimas, Lowry analizė ir bicinchoninic rūgštis (BCA) tyrimas yra bendri tyrimai, siekiant nustatyti baltymų koncentracija. Galvijų serumo albuminas (KPP) yra vienas dažniausių baltymo etalono.

Lizės buferis

Lizės buferis turi būti parinktas pagal ląstelių medžiagą ar audinį (audinių kultūra, augalas, bakterijos, grybai ir kt.) ir ar ląstelės yra struktūroje, ar struktūros tipas. Platus lizės buferių, skirtų baltymams, membranoms ir organoidus išgauti, asortimentas yra suformuluotas su vienu ar daugiau ploviklių. Paprastai ploviklis pasirenkamas atliekant bandymų ir klaidų – Jei yra – pagal esamą baltymų ekstrahavimo protokolą. Ploviklis turi būti suderinamas su audinių šaltiniu ir baltymais. Apskritai, yra parenkamas mildest ploviklis, kuris dirba tam tikrų audinių/baltymų, siekiant išlaikyti maksimalų funkcionalumą ekstrakto. Be to, esant membranų ir organoidus ekstrahuojant, švelnus ploviklis išlaiko membraną nepaliestas. Dažniausiai naudojami lizės buferių plovikliai dažniausiai yra nejoniniai arba zwitterioniniai, pvz., CHAPS, deoksicholatas, Triton™ X-100, NP40 ir Tween 20.
Pavyzdžiui, audiniai, tokie kaip smegenys, kepenys, žarnynas, inkstai, blužnis ir kt., gali būti tiesiog buferinis su RIPA – proteazių inhibitorius ir DTT (pvz., gelio elektroforeze).
Lizės buferinis tirpalas skeleto raumenims (lediniam šalčiui): 20 mm Tri (pH 7,8), 137 mm NaCl, 2,7 mm KCl, 1 mm MgCl2% Triton X-100, 10% (m/v) glicerolio, 1 mm EDTA, 1 mm ditiotreitolio papildytas proteazės ir fosfatazės inhibitoriumi kokteilis
Bendrų buferių lentelė ir jų pH intervalas. Apskritai šie buferiai paprastai naudojami esant 20-50 mM koncentracijai.

Buferio pH diapazonas
Citrinų rūgštis – Naoh 2,2 – 6,5
Natrio citratas – Citrinų rūgštis 3,0 – 6,2
Natrio acetatas – acto rūgštis 3,6 – 5,6
Cacodylic rūgšties natrio druska – Hcl 5,0 – 7,4
Res – Naoh 5,6 – 6,8
Natrio-divandenilio fosfatas – dinatrio vandenilio fosfatas 5,8 – 8,0
Imidazolo – Hcl 6,2 – 7,8
MOPS – Koh 6,6 – 7,8
Trietanolamino hidrochloridas – Naoh 6,8 – 8,8
Tris – Hcl 7,0 – 9,0
HEPES – Naoh 7,2 – 8,2
Tricinas – Naoh 7,6 – 8,6
Natrio tetraboratas – boro rūgštis 7,6 – 9,2
Bicinas – Naoh 7,7 – 8,9
Glicinas – Naoh 8,6 – 10,6

Dauguma buferių rodo pH priklausomybę nuo temperatūros. Tai ypač pasakytina apie tris buferiai. PKa keičiasi nuo 8,06 25 ° c iki 8,85 esant 0 ° c.
(pH ir pKa buferio: pH matuoja vandenilio jonų koncentraciją vandeniniame tirpale. pKa (= rūgščių Disociacijos konstanta) yra susijusi, bet konkretesnė priemonė, nes ji padeda prognozuoti, kaip molekulė veiks esant konkrečiam pH vertei.)

Trizolis

TRIzol yra cheminis tirpalas, naudojamas RNR/DNR/baltymui guanidinio tiocianato-fenolio-chloroformo ekstrakcijos metu. Ultragarsu padeda TRIzol gavyba rezultatai aukštos DNR, RNR, ir baltymų derlingumą iš to paties mėginio ir pranokti taip kitų ekstrahavimo metodus.