Hielscher ultragarso technologijos

Ultragarsinis suirusių E. Coli

  • E. coli bakterijos yra dažniausiai naudojamas bakterijų mikrobiologijos ir biotechnologijų.
  • Ultragarso ląstelių endokrininę pateikti patikimus ir atkuriamas rezultatus dėl E. coli lizės.
  • Intensyvi, tačiau tiksliai kontroliuojama kavitacija ir šlyties jėgos sukelia visišką sutrikimą ir didelį ekstrahavimo derlių (pvz., baltymai, DNR).

Mobilusis sutrikimas pagal Kavitacijos

Escherichia coli bakterijos yra patikimai lizsed naudojant ultragarso audinio homogenizatoriai.Ultragarso zondą tipo homogenizatoriai veikia su maždaug 20 000 ciklų per sekundę (20kHz) ir sukelti išsiplėtimą skysčių ar supsensions. Akustinė kavitacija mikroskopinių sričių vakuumo kaip slėgis ir aukšta temperatūra, kad ašarų ląstelių atskirai. Nors temperatūra gali pasiekti keletą tūkstančių laipsnių Celsijaus, išsiplėtimą apimtys yra tokios mažos, jie neturi šildyti procesą žymiai. Ultragarso generuoja akustinės išsiplėtimą ir šlyties jėgų perforuoti arba pertrauka ląstelių membranos E. coli – priklausomai nuo prietaiso nustatymo ultragarso homogenizatorius.

Privalumai Ultragarsinis Lizsis

  • tiksli lizės kontrolė (intensyvumas, amplitudė, temperatūra)
  • optimalų prisitaikymą prie konkrečių ėminių
  • temperatūros kontrolė
  • labai mažiems ir labai dideliems mėginiams (nuo μL iki litrų)
  • grynas mechaninis apdorojimas
  • linijinis nuo laboratorijos iki gamybos
Ultragarso prietaisas VialTweeter leidžia vienu metu mėginio paruošimo iki 10 buteliukų pagal tas pačias proceso sąlygas. (Paspauskite, Norėdami padidinti!)

VialTweeter Ultragarso lizės

Informacijos užklausa




Atkreipkite dėmesį į mūsų Privatumo politika.


Nors cheminė ir fermentinė lizė gali kelti problemų – kadangi cheminis lizė gali pakeisti baltymų struktūras ir nustatyti valymo problemas bei fermentinį lizę reikalauja ilgų inkubacinių laikotarpių ir nėra atkuriamas – Ultragarso sutrikimų yra sudėtingas, greitai ląstelių sutrikimo metodas.
Ultragarsinis lizės pagrindas yra tik mechaninėmis jėgomis. Nepridedamos jokios cheminės medžiagos, ultragarsu ląstelių sienelės sulaužomos šlyties jėgomis. Cheminė lizė gali pakeisti baltymų struktūrą ir sukelti valymo problemų. Fermentinis sutrikimas reikalauja ilgo inkubacijos laiko ir nėra atkuriamas. Ultragarsinių ląstelių sutrikimas E.coli bakterijų ląstelėse yra greitas, paprastas, patikimas ir atkuriamas. Štai kodėl Hielscher ultrasonicators yra naudojami biologinių ir biocheminių laboratorijų visame pasaulyje mėginių paruošimo, pre-ananlytics, in vitro diagonstics ir kolektoriaus tyrimus.

Bendrosios rekomendacijos

UP400St ultrasonicator su srauto reaktoriumiPašalinkite yra populiariausias būdas lizinio labai mažas, vidutinio ir didelio kiekio ląstelių suspensijos – nuo Pico-litrų iki 100L/h (naudojant ultragarso srauto ląstelių). Ląstelės yra lizuotos skystos žirklės ir išsiplėtimą. DNR taip pat nuskambėjo per ardymo ultragarsu, todėl nėra būtina pridėti DNase ląstelių suspensija.
Temperatūros kontrolė:
Ėminys iš anksto aušinamas ir laikant mėginį ardymo ultragarsu metu, bandinio terminio skilimo mėginį galima lengvai išvengti.
Idealiu atveju ėminiai turėtų būti laikomi lizės šaltyje, tačiau daugumai mėginių pakanka, kad temperatūra nepakiltų virš kultūros ar audinių šaltinio temperatūros. Todėl rekomenduojama, išlaikyti suspensiją ant ledo ir Paveikite keletą trumpų Ultrasonics impulsų iš 5-10 sek ir pauzes 10-30 sek. Per pauzes, šiluma gali išsklaidyti siekiant atkurti žemos temperatūros. Didesniems ląstelių mėginiams galima naudoti įvairius srauto ląstelių reaktorius su aušinimo liemenes.

Protokolai dėl E. coli preparato paruošimo.

Ekspresijos analizė ir rekombinantinio baltymo gryninimas

E. coli granulės buvo sunaikintos Ultragarsas su ultragarso sistema UP100H (Hielscher). Šiuo tikslu ląstelių granulės buvo pakartotinai suspenduotos atšaldyto lizės buferyje (50 mM Tris-HCl pH = 7,5, 100 mM NaCl, 5 mM DTT, 1 mM PMSF) ir aušinamos ledu 10 min. Tada, ląstelių suspensija buvo sunaikintos Ultragarsas su 10 trumpų eilių 10 s, po to intervalas 30 s aušinimo. Galiausiai, ląstelių nuolaužos buvo pašalintos ultracentrifugavimo 4 ° c temperatūroje 15 min, esant 14000 RPM. Dėl rPR išraiškos, supernatantas buvo paleisti 12% poliakrilamido gelio ir analizuojami SDS-PAGE ir Western blotting. RPR valymas buvo atliktas naudojant ni2 +-NTA derva (Invitrogen, JAV) pagal gamintojo vadovą. Šiame etape buvo naudojamas vietinis gryninimo metodas. Išgryninto baltymo grynumas buvo įvertintas naudojant elektroforezę 12% poliakrilamido geliu ir vėliau Coomassie mėlynai nusidažant. Išgryninta baltymų koncentracija buvo matuojama Micro BCA baltymų tyrimo rinkinys (PIERCE, JAV). (Azarnezhad et al. 2016)

Ultragarso ląstelių disruptor UP100H (100W) lizės, ląstelių sutrikimų ir DNR kirpimo.

Ultragarso homogenizatorius UP100H 100W

Mobilusis augimas, Crosslinking ir paruošimas E. coli ląstelių ekstraktai

SeqA ir RNR polimerazei ChIP-Chip E. coli MG1655 arba MG1655 ΔseqA buvo auginami 37 ° c600 apie 0,15 50 ml LB (+ 0,2% Gliukozė) prieš 27 μl formaldehido (37%) kiekis (galutinė koncentracija 1%). Buvo atlikta Crosslinking (100 RPM) kambario temperatūroje 20 min, po to numalsuojasi 10 ml 2,5 M glicino (galutinė koncentracija 0,5 M). Šilumos smūgio eksperimentams E. coli MG1655 buvo auginami 65 ml LB terpėje 30 ° c temperatūroje600 apie 0,3. Vėliau 30 ml kultūros buvo perkelta į pašildytas kolbas esant 43 ° c temperatūrai, o likusi dalis laikoma 30 ° c temperatūroje. Crosslinking ir aušinimas buvo, kaip aprašyta pirmiau, išskyrus tai, kad ląstelės buvo laikomos 30 arba 43 ° c temperatūroje 5 min prieš dar lėtai kratant kambario temperatūroje. Ląstelės buvo surinktos centrifuguojimo metu ir plaunama du kartus su šaltu TBS (pH 7.5). Pakartotinai suspendavus 1 ml lizės buferiniame tirpale (10 mM tris (pH 8,0), 20% sacharozės, 50 mM NaCl, 10 mM EDTA, 10 mg/ml lizocimo) ir inkubacijai 37 ° c temperatūroje 30 min, po to pridedant 4 ml IP buferį, ląstelės buvo sunaikintos Ultragarsas ant ledo 12 kartų 30 sek ir 30 sek. tam UP400St Ultragarso procesorius (Hielscher Ultrasonics GmbH) su 100% galios. Po 10 min. centrifugavimo esant 9000 g temperatūrai, 800 μl alikvotinis supernatantas buvo laikomas – 20 ° c temperatūroje. (Waldminghaus 2010)

Fermentų perprodukcija ir gryninimas.

Perprodukcija iš decahistidino (His10)-Tagged baltymai, E. coli BL21 (DE3) buvo pertvarkyta su pET19b stato. Per naktį buvo nuimta centrifuguojama ir 1% buvo naudojama išraiškos kultūrai inaktyvuojant. Ląstelės, vežančios pET19mgtB, buvo auginamos 22 ° c temperatūroje, kol optinis tankis 600 nm600) 0,7. Kultūra buvo perkelta į 17 ° c ir sukėlė 100 μM IPTG. Po 16 h, kultūra buvo nuimta centrifuguoti 7 500 × g esant 4 ° c temperatūrai. Ląstelės buvo resuspenduotos 50 mM fosfato buferinis fiziologinio tirpalo (PBS) su 0,3 M NaCl pH 7,4 ir sutrikdoma ultragarsu su S2 mikro Patarimas sonotrode UP200St ultrasonicator (Hielscher, Teltow, Vokietija) bent ciklas 0,5 ir amplitudės 75%.
Decahistidino ir pažymėto GtfC perprodukcija buvo sukelta 37 ° c temperatūroje600 0,6 su 100 μM IPTG. Po to ląstelės inkubuojami 4 h, išauginti ir lizuoti, kaip nurodyta pirmiau už MgtB.
Žalių ląstelių ekstraktai buvo centrifuguoti esant 15 000 × g ir 4 ° c temperatūrai nuosėdų ląstelių nuolaužų. Patikslintos ekstraktai buvo pakrauti į 1-ml HisTrap FF žalios stulpelius naudojant ÄKTAprime Plus sistemą (GE Healthcare). Fermentai buvo išgryninti pagal gamintojo protokolą, kad būtų suleistas jo pažymėtų baltymų gradientas. Eluted proteinų tirpalai buvo dializuojami du kartus, prieš 1 000 tūrio 50 mM PBS, pH 7,4, su 0,3 M NaCl 4 ° c temperatūroje. Valymas buvo analizuojamas 12% SDS-PAGE. Baltymų koncentracija buvo nustatyta Bradfordo metodu, naudojant Roti-Quant (Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Vokietija). (Rabausch et al. 2013)

Baltymų ekstrahavimas iš E. coli bakterijų
Masalas baltymų palūkanų (šiuo atveju, MTV1 iš Arabidopsis thaliana) yra lydyto į GST žyma ir išreikšta BL21 Escherichia coli (E. coli) ląstelių.
1. Paimkite vieną granulę GST-MTV1 ir GST (atitinkančią 50 ml bakterijų kultūros) ir Resuspenduokite kiekvieną 2,5 mL ledo šalto ekstrahavimo buferiniame tirpale.
2. Naudokite ultrasonicator UP100H (įrengta su MS3 microtip-sonotrode mažų tūrių (2-5mL)) sutrikdyti bakterijų ląsteles, kol jie yra lizuotas, kuris yra nurodytas dėl sumažėjusio neskaidrumo ir padidinti klampumo. Tai turi būti atliekama ant ledo, ir rekomenduojama Paveikite intervalais (pvz., 10 sek ultragarsu po 10 sek ant ledo ir tt). Turi būti imamasi atsargumo priemonių, kad nebūtų paveikta per didelio intensyvumo. Jei nustatomas putojimas ar baltų nuosėdų susidarymas, intensyvumas turi būti sumažintas.
3. lizuotų bakterijų tirpalą perpilti į 1,5 mL mikrocentrifugos mėgintuvėlius ir centrifuguojama esant 4 ° c temperatūrai, 16 000 x g 20 min.

Alicino modifikuoti baltymai E. coli

Į VialTweeter yra patogus ultrasonicator mažų mėginio homogenizavimoSulfhidrilo turinio nustatymas 5, 5 ′-ditio (2-nitrobenzenkarboksirūgšties) (DTNB) teste
MOPS minimali terpė (1:100) buvo naudojama E. coli MG1655 nakties kultūra. Kultūra buvo auginami aerobiškai, kol 0,4 buvo pasiektas A600. Kultūra buvo padalintas į 3 15 ml kultūrų streso gydymui. Neapdorota kultūra tarnavo kaip neigiama kontrolė. 0,79 mm alicinas (128 μg ml-1) arba 1 mM diamidas buvo pridėtas prie vienos iš likusių dviejų kultūrų. Kultūros buvo inkubuotos 15 min. 5 ml kiekvienos kultūros buvo nuimta centrifuguojama (8 525 × g, 4 ° c, 10 min). Ląstelės buvo plaunamos du kartus su 1 ml PBS (137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na2Ir HPO4, 2 mM KH2PO4, pH 7,4, saugomas anaerobiniu būdu prieš naudojimą) ir centrifuguojamas (13 000 × g, 4 ° c, 10 min). Ląstelės buvo pakartotinai suspenduotos lizės buferiniame tirpale (PBS su 6 mM guanidinio HCl, pH 7,4) iki sutrikdymo 4 ° c temperatūroje ultragarsu (VialTweeter ultrasonicator, Hielscher GmbH, Vokietija) (3 × 1 min). Ląstelių nuolaužos buvo granuliacijos centrifuguoti (13 000 × g, 4 ° c, 15 min). Supernatantas buvo perkeltas į 3,5 ml QS-makro kiuvetės (10 mm) su magnetine maišymo juosta ir sumaišytas su 1 ml lizės buferio. Mėginių išnykimas buvo stebimas esant 412 nm, Jasco V-650 spektrofotometras su PSC-718 temperatūros kontroliuojamu ląstelių laikikliu (Jasco) kambario temperatūroje. 100 μl 3 mM dithiobis (2-nitrobenzenkarboksirūgšties) tirpalo. Išnykimas buvo stebimas tol, kol jis pasiekė soties. Tiolo koncentracijos apskaičiavimas buvo atliktas taikant ekstinkcijos koeficientą ε412 = 13 700 M-1 Cm-1 dėl thio-2-nitrobenzenkarboksirūgšties (TNB). Ląstelių tiolio koncentracija buvo apskaičiuota pagal E. coli ląstelių kiekį 6,7 × 10-15 litro ir ląstelių tankis600 = 0,5 (atitinka 1 × 108 ląstelių ml;-1 kultūra). ("Müller et al. 2016")

In vivo glutationo nustatymas

E. coli MG1655 buvo išauginta MOPS mažoje terpėje, kurios bendras tūris yra 200ml, kol A600 0,5 buvo pasiekta. Kultūra buvo padalintas į 50 ml kultūrų streso gydymui. Po 15 min inkubacijos su 0,79 mM alicinu, 1 mM diamidu arba dimetilsulfoksidu (kontrole), ląstelės buvo nuimtos po 4, 000g 4 ° c temperatūroje 10 min. ląstelės buvo plaunamos du kartus su KPE buferiniu tirpalu prieš pakartotinai suspendavus granules 700 μl KPE buferinio tirpalo. Deproteination, prieš sutrikdžius ląstelių suardymo (3 x 1 min.) buvo pridėta 300l 10% (m/v) sulfosalicilo rūgšties. VialTweeter ultrasonicator). Supernatantai buvo surinkti po centrifugacijos (30 min, 13, 000g, 4 ° c). Sulfosalicilo rūgšties koncentracija buvo sumažinta iki 1% pridedant 3 tūrius KPE buferinį tirpalą. Kaip aprašyta pirmiau, buvo atlikti viso glutationo ir GSSG matavimai. Ląstelių glutationo koncentracija buvo apskaičiuota pagal E. coli bakterijų kiekio 6,7×10-15 litro ir ląstelių tankis600 0.5 (atitinka 1×108 ląstelių ml;-1 kultūra). GSH koncentracija buvo apskaičiuota atimant 2 [GSSG] iš viso glutationo. ("Müller et al. 2016")

Ultragarso disruptor ląstelių lizės ir gavybos biologinių medžiagų (paspauskite, Norėdami padidinti!)

Zondo tipo ultrasonicator UP400St

Išraiška žmogaus mAspAT E. coli

Ultragarso ląstelių disruptor UP400St (400W) ląstelėje medžiagos ekstrahavimui (pvz., baltymai, organoidus, DNR, RNR ir kt.)Viena kolonija E. coli BL21 (DE3), kurios metu buvo reišktas posakis vektoriumi 30 mL Luria-Bertani (LB) terpėje, kurioje yra 100μg/mL ampicilino, ir tada dirbama esant 37 º C temperatūrai, kol optinis tankis (OD600) pasiekė 0,6. Ląstelės buvo nuimtos centrifuguojimo metu 4 000 × g 10 min. ir resuspenduotos 3L šviežioje LB terpėje, kurioje yra 100μg/mL ampicilino.
Vėliau baltymų ekspresiją sukėlė 1 mM izopropilo β-ᴅ -1-tiiogalvakozido (IPTG) 20 h esant 16 ° C temperatūrai. Ląstelės buvo surinktos 15 min centrifuguojimo metu 8 000 × g ir plaunamos A buferiniu tirpalu A (20 mM NaH2PO4, 0,5 M NaCl, pH 7,4). Apytiksliai 45g (drėgnų svorio) ląstelės buvo gautos iš 3 L kultūros. Po centrifugavimo ląstelių granulės buvo resuspenduotos 40 mL (1 L kultūros) ledinio ekstrahavimo buferiniame tirpale A ir lizuotas ultragarsu ledinio temperatūros sąlygomis, naudojant UP400St priemonę (Dr. Hielscher GmbH, Vokietija). Ląstelių lizė buvo centrifuguota ne 12 000 RPM 15 min, kad atskirtumėte tirpią (supernatanto) ir nusodinto (granulių) frakcijas. (Jiang et al. 2015)

Žemiau pateiktoje lentelėje pateikiama apytikslė mūsų ultragarsu apdorojimo pajėgumo informacija:

Serija tomas srautas Rekomenduojami prietaisai
0.5 iki 1.5mL Nėra duomenų | VialTweeter
Nuo 1 iki 500mL 10-200 ml / min UP100H
Nuo 10 iki 2000 ml 20-400 ml / min UP200Ht, UP400St
0.1 iki 20L 0.2 iki 4L / min UIP2000hdT
Nuo 10 iki 100L Nuo 2 iki 10 l / min UIP4000
Nėra duomenų | 10 - 100 l / min UIP16000
Nėra duomenų | didesnis klasteris UIP16000

Susisiekite su mumis! / Klausk mus!

Jei norite paprašyti papildomos informacijos apie ultragarso homogenizavimą, naudokite žemiau esančią formą. Mums bus malonu pasiūlyti ultragarso sistemą, atitinkančią jūsų reikalavimus.









Atkreipkite dėmesį, kad mūsų Privatumo politika.


Literatūra / Literatūra



Faktai verta žinoti

E. coli

Escherichia coli (E. coli) yra gramneigiamų, fakultatyviu anaerobinis, strypo formos, koliforminės bakterijos genties Escherichia, kad paprastai randama apatinių žarnų šiltakraujų organizmų (endotermų). Yra daug E. coli padermių (arba potipių) su įvairiomis savybėmis. Dauguma E. coli bakterijų yra nekenksmingos žmonėms, pvz., B ir K-12 padermės, kurios paprastai naudojamos moksliniams tyrimams taikomosiose laboratorijose. Tačiau kai kurios padermės yra kenksmingos ir gali sukelti sunkią ligą.
E. coli vaidina svarbų vaidmenį šiuolaikinės biologinės inžinerijos ir pramonės mikrobiologijos, nes bakterijos yra lengvai manipuliuoti. Bendrosios laboratorijos taikomosios programos, kurios dažnai naudoja E. coli, pvz., sukurti rekombinantinę dezoksiribonukleino rūgštį (DNR) arba veikti kaip pavyzdinis organizmas.
E. coli yra labai universalus priimančiosios už heterologinių baltymų gamybai, ir kolektoriaus baltymų ekspresijos sistemos yra gaminami rekombinantinių baltymų E. coli. Naudojant plazmidės, kurios leidžia aukšto lygio ekspresiją baltymų, genai gali būti įvežami į bakterijas, kuri leidžia gaminti tokius baltymus dideliu kiekiu pramoninės fermentacijos procesų.
E. coli naudojami kaip ląstelių fabrikai gaminti insulino. Kitos paraiškos apima modifikuotų E. coli ląstelių naudojimą kuriant ir gaminant vakcinas ir imliuotus fermentus, gaminant biokurą, taip pat bioremediacijai.
Padermė K-12 mutantas forma E. coli, kad per-išreiškia fermento šarminės fosfatazės (ALP). Ši mutacija atsiranda dėl genų defektas, kad nuolat kodai fermento. Jei genas gamina produktą be jokio slopinimo, tai vadinama steigiamumu. Ši specifinė mutančia forma naudojama izoliacijos ir valymo ALP fermentas.

Ultragarsinis DNR karpymas

Ultragarso šlyties jėgų yra dažniausiai naudojamas metodas atskirti nuo ląstelės ir pertrauka DNR sruogų į gabalus. Akustinė kavitacija pertraukos ląstelių sienelių ir membranas išgauti DNR iš ląstelių ir generuoti fragmentai apie 600 – 800 BP ilgio, kuris idealiai tinka analizei.
Spauskite čia Norėdami sužinoti daugiau apie ultragarso homogenizatoriai DNR fragmentacijos!