Hielscher ultragarso technologijos

Ultragarsinis DNR karpymas

  • DNR ir RNR shearing metu DNR molekulės suskaidytos į mažesnius gabalėlius. DNR/RNR fragmentacija yra vienas iš svarbiausių imties prep veiksmus reikia sukurti bibliotekų naujos kartos sekos (NGS).
  • Ultragarso DNR kirpimo naudoja akustinės Kavitacijos jėgų nutraukti DNR ar RNR į gabalus 100 – 5kb BP.
  • Ultragarso kirpimo leidžia tiksliai DNR fragmentacijos ir prisitaikymas prie norimo DNR ilgį.

Ultragarsinis DNR karpymas

Hielscher Ultrasonics siūlo įvairius ultragarso pagrindu sprendimus DNR, RNR ir Chromatinas kirpimo. Pasirinkti tarp zondo tipo ultrasonicators (pvz., UP100H) tiesioginės ardymo naudojant microtip, arba naudoti VialTweeeter arba ultragarso CupHorn netiesioginio DNR paruošimo įvairių mėginių vienu metu. Hielscher siūlo idealus prietaisas atsižvelgiant į jūsų poreikius: Oras turite 1 arba iki 10 mėginių, apimtis nuo mikrolitro iki litro apimtis – Hielscher ultragarso perdirbėjai yra patenkinti jūsų reikalavimus parengti DNR, RNR ir chromatines fragmentus į dešinę ilgio. Atkuriamumas, lengvas veikimas ir tikslus valdymas leidžia patikimai bibliotekos naujos kartos sekos.
Skirtingai nuo fermentinių DNR fragmentacijos, Ultragarsinis kirpimo metu taikomos mechaninės šlyties jėgos, nepridedant jokių chemikalų. Tiksliai nustatant proceso parametrus, ultragarso kirpimo gamina didelės molekulinės masės DNR fragmentai (plazmidės ir genominės DNR).
Išgrynintos nukleino rūgštys gali būti amplifikuoti prieš arba po fragmentacijos žingsnio.
Ardymo parametrai (galia, impulso ciklas/eilių, laiko ir temperatūros) gali būti valdomas saugiai per programinės įrangos nustatymus.

Privalumai:

  • tikslus valdymas
  • ardymo ciklų ir laiko tiksliai prisitaikyti prie norimo DNR dydis
  • didelės molekulinės masės DNR fragmentai
  • temperatūros kontrolė
  • Greitai
  • Atkuriamas rezultatas
  • autoclavable
  • Įvairūs sprendimai: Zondo tipas, VialTweeter ir Į CupHorn

Protokolai ultragarso DNR kirpimo

Dėl Chromatin immunoprecipitation analizė

Trumpai sakant, ląstelės buvo padengtos 60mm skersmens indais (400 000 už patiekalas) ir genu su rhoa sirna (kaip aprašyta); po 72 h, jie buvo inkubuojami formaldehido (galutinė koncentracija, 1%) 10 min 37 ° c temperatūroje kryžminių nuorodų baltymams į DNR. Kryžminė siejanti reakcija buvo numaldyta pridedant vieną dešimtąją tūrį 1,25 mol/L glicino, suteikiant 125 mmol/L galutinę koncentraciją. Ląstelės buvo plautos du kartus su ledinio PBS, pakartotinai suspenduotos radioimunoprecipitation tyrimo buferiniame tirpale [150 mmol/L NaCl, 1% NP40, 0,5% deoksicholato, 0,1% SDS, 5 mmol/L EDTA, 50 mmol/L tris-HCl (pH 8,0)], kurių sudėtyje yra 1 mmol/l 1 AG/mL pepstatino A ir 30 min. laikomi ledu. Tada, ląstelių lizatai buvo sunaikintos Ultragarsas ant ledo su Hielscher UP200S Ultragarso išsklaidydami (3 x 40 s, amplitudės 40%, 1 ciklas; Hielscher Ultrasonics GmbH), kol kryžminio susiję chromatins buvo nukirsti duoti DNR fragmentai tarp 200 ir 1 000 BP. Vienas dešimtadalis viso lizato buvo naudojamas siekiant kiekybiškai įvertinti įvairiuose mėginiuose esančių DNR kiekį ir “bendra DNR”. Supernatantai buvo inkubuojami lašišos spermos DNR/baltymų agarozės-50% srutos sumažinti nespecifinis fone. Imunoprecipitation buvo atlikta per naktį 4 ° c temperatūroje su 5 AG anti-NF-nB p65 (pietūs) arba be antikūnų (neigiama kontrolė). Šie supernatantai buvo papildyti 5 mol/L NaCl ir pašildomi per naktį 65 ° c, kad būtų sugrąžinti baltymų ir DNR kryžminis ryšys. Imunokompleksai toliau buvo gydomi DNase-ir RNase be proteinazės K, ir DNR buvo išgryninta fenolio/chloroformo gavyba ir etanolio kritulių. PGR buvo padaryta su konkrečiais pradmenimis, atitinkančiais seką, esančią aktyvatoriaus regione žmogaus iNOS geną (P1 gruntas: 5 ¶-GAGGGCTTTCCCA-GAACCAAG-3 ¶; P2 gruntas: GCTGGGCTACTGACCCAG-CAGTTCCAG-3 ¶). (Doublier et al., 2008)

EGFP ekspresijos tyrimai

Ekspresijos studijų, rekombinantinės padermės L. tarentolae P10:: F9Begfp 1.4 dBsat # 12 (jena BioScience, Vokietija) su EGFP genų (sustiprintas žalios fluorescencinės baltymų), chromosomų SSU integruota, buvo auginami įvairių žiniasklaidos priemonių, kaip aprašyta buvo papildomai papildytas 100 mg l-1 Nourseothricin (jena BioScience, Vokietija). Kultivavimo metu buvo paimti 1 ml mėginiai, centrifuguoti (2000 × g, 20 ° c, 10 min.) ir nuplauti 0,9% NaCl tirpalu. Granulė buvo pakartotinai suspenduota buferiniame tirpale (20 mM HEPES, 5 mM EDTA, 2 mM DTT) ir suskaidyta sonifikacija su ultragarso procesoriumi UP400S (energijos vartojimo ∼ 400 WS). Ląstelių nuolaužos buvo pašalintos centrifuguant (6000 × g, 4 ° c, 5 min) ir išanalizuotos natrio dodecilsulfato – poliakrilamido gelio elektroforezės (SDS-PAGE) metodu, sumažinant sąlygas pagal Laemmli metodą (1970) su 12,5% poliacralamido geliai. EGFP ekspresiją išnagrinėjo susijaudinęs kultūra. (Fritsche et al. 2007)

Hielscher's UP100H was used to prepare EHEC DNA for chip array analysis

Electrophoretic analizė geninės DNR E. coli EDL933 taikomas 0 – 15 min ultragarsu. L rodo DNR kopėčios. (Basselet et al. 2008)

Informacijos užklausa




Atkreipkite dėmesį į mūsų Privatumo politika.


Chromatin imunoprecipitation

Ultragarso ląstelių disruptor UP100H (100W) lizės, ląstelių sutrikimų ir DNR kirpimo.Į chromatino imunoprecipitation tyrimas buvo atliktas naudojant ChIP-ITTm Express (aktyvus motyvas, Carlsbad, CA, JAV) pagal gamintojo instrukcijas su kai kuriais pakeitimais. Trumpai tariant, diferencijuotas žmogaus podocytes buvo kryžminių susijęs su 1% formaldehido 10 min kambario temperatūroje. Ląstelės buvo nuplaunamos ledinio PBS ir fiksacijos reakcija buvo sustabdyta, pridedant 0,125 M glicino 5 min kambario temperatūroje. Ląstelės buvo nuplaunamos vėl su ledinio PBS ir pavogta iš patiekalas. Ląstelės buvo granuliuotos centrifuguoti ir pakartotinai suspenduojant lizės buferyje. Centrifuguoti granuliuoti branduoliais buvo pakartotinai suspenduota šlyties buferiniame tirpale, 30 min inkubuojami ledu, o chromatino buvo nukaldinta ultragarsu, pvz., UP100H (Hielscher Ultrasonics GmbH, Teltow, Vokietija) 25% galios 5 impulsų 20 sek. Kiekvienas ant ledo fragmentai maždaug 200-600 BP. Po to nukirpimo chromatas buvo centrifuguojamas ir skystis virš nuosėdų buvo surinktas. Imunoprecipitations, 60 μl chromatino buvo inkubuojama 1 μg SP1 (Santa Cruz biotechnologijos, Santa Cruz, CA, JAV), NF-κB p65 (Abcam, Kembridžas, Jungtinė Karalystė) arba NF-κB P50 (Abcam) antikūnų arba triušio IgG (Zymed laboratorijos, Pietų San Franciskas, CA, JAV), kaip per naktį 4 ° c temperatūroje švelniai pasukant. Su magnetiniais karoliukais susieti imunokompleksai buvo surinkti naudojant magnetinį stovą, plačiai išplautą, o baltymų/DNR kryžminėms buvo atvirkštinės, o DNR išplaunama tikruoju laiku atliekant PGR analizę. (Ristola et al. 2009)

EHEC DNR paruošimas žetonų masyvų analizei

Ląstelių lizatų ir ekstrahuotų DNAs išdėstymas
Bakterijų granulės, suspenduotos PBS, iki norimos galutinės koncentracijos buvo apdorotos Ultragarso disruptor UP100H (Hielscher GmbH, Vokietija) su mikrogaliuku MS1 (1mm skersmens). Veikimo dažnis buvo 30 kHz, o efektyvi išėjimo galia – 100 W. Operacijos metu mėginiai buvo ataušinti ledo vandens vonioje, sumaišyti ir centrifuguoti. Mėginiai buvo panaudoti tėkmės citometrijos tyrimams atlikti, o vėliau juos apdorojant bandiniai termiškai apdorojami (95 ° c, 5 min). Žalios ląstelės lizatai buvo apdoroti fenolio mišiniu: chloroformu: izoamilo alkoholiu (25:24:1). Į lizato mėginį buvo įdėta tokio pat tūrio šio mišinio, tirpalas buvo stipriai netesuojamas 15 s, centrifuguojamas esant 15 000 × g 2 min, esant kambario temperatūrai (RT) apie 22 ° c. Viršutinis vandeninis etapas, kuriame yra genominė DNR, buvo kruopščiai atskirtas ir surinktas naujame steriliame Eppendorf mėgintuvėlyje.
Vėliau mėginiai buvo sunaikintos Ultragarsas, kad fragmentas DNR. Ardymo žingsnis buvo įgyvendinta tomis pačiomis sąlygomis, kaip aprašyta aukščiau. Siekiant įvertinti fragmentacijos poveikį genominės DNR, mėginiai buvo analizuojami naudojant agarozės gelio elektroforezę.
(…) Prieš 2,5 min. sunaikintos Ultragarsas mėginiai buvo ekstrahuoti po terminio apdorojimo ir centrifugavimo. Išleista DNR išgaunama du kartus su fenoliu: chloroformu: izoamilo alkoholio deriniu, o po to – antru ardymo metodu 0 – 15 min. agarozės gelio elektroforezė buvo naudojama siekiant nustatyti DNR, kuriai taikomas po ekstrahavimo fragmentaciją (pav. viršutinėje dešinėje pusėje). Labai fragmentuota DNR buvo akivaizdu iš DNR tepinėlio buvimas, o ne didelės molekulinės masės juostų, kurios buvo pašalintos iš mėginių Ultragarsas 2,5 min arba ilgiau. Ilgesnis ardymo palaipsniui sumažinti fragmentas ilgis maždaug 150-600 BP, ir ardymo 15 min toliau degradavę šių fragmentų, kaip galima pastebėti daugiausia viršutinė dalis tepinėlio. Taigi, vidutinis DNR fragmentas dydis palaipsniui mažėjo su ultragarsu laiko ir 5 min gydymas leido gauti iš DNR fragmentai dydžiai labiausiai tinka mikroschemų masyvo tyrimams. Pagaliau, DNR analitės paruošimo procedūra, apimanti pirmąjį 2 min Ultragarsinis gydymas, DNR gavyba (2 ×), ir vėliau 5 min ardymo, buvo nustatyta. (Basselet et al. 2008)

Chromatin immunoprecipitation (ChIP)

Ultragarso procesorius UP100H DNR, RNR ir Chromatinas kirpimo. (Paspauskite, Norėdami padidinti!)HEK293 ląstelės buvo išauginti, kaip aprašyta aukščiau ir nustatytos 2 mM disuccinimidyl-glutarate už 45 min kambario temperatūroje. Vėliau ląstelės buvo plaunamos du kartus su PBS. Chromatino buvo per 10 minučių sujungtas su kambario temperatūra, naudojant 1% (v/v) formaldehidą ir du kartus plaunamas šaltu PBS. Kryžminio susiejimo reakcija buvo sustabdyta inkubacijos metu glicinu, kurio galutinė koncentracija yra 0,125 M 5 min kambario temperatūroje. Po inkubacijos su tripsinu ląstelės buvo pavogtos iš ląstelių kultūros indo ir du kartus plaunama PBS. Ląstelių granulės buvo pakartotinai suspenduotos lizės buferyje (5 mM vamzdžiai, pH 8,0, 85 mM KCl ir 0,5% (v/v) Nonidet P-40), inkubuojami ant ledo 10 min ir homogenizuoti su Dounce homogenizatoriumi. Vėliau branduolys buvo granuliuotas centrifuguoti (3500 x g, 5 min, 4 ° c) ir pakartotinai suspenduojant branduolių buferyje (50 mM Tris-HCl, pH 8,1, 10 mM EDTA ir 1% (m/v) SDS). Nuclei buvo sutrikę pašalinkite su 3 20-s impulsus į UP50H išsklaidydami (Hielscher Ultraschall Technologie) į ciklą 0,5 ir amplitudės nustatymas 30%, duoda geninės DNR fragmentai su urmu dydis 200-1000 BP. Dėl lusto 50g DNR buvo praskiestas 4 kartus imunoprecipitation buferiniame tirpale (16,7 mM Tris-HCl, pH 8,1, 167 mM NaCl, 1,2 mM EDTA, 1,1% (v/v) Triton X-100, ir 0,01% (m/v) SDS). (Weiske et al. 2006)

Histono pakeitimo analizė Chromatinas imunoprecipitation (ChIP)

Trumpai tariant, 6 x 106 ląstelės buvo plautos du kartus, naudojant PBS, ir per 15 min. kryžmines sujungtas su lėkštelės temperatūra kambario temperatūroje, esant 0,5% formaldehido buvimui. Kryžminio susiejimo reakcija buvo sustabdyta pridedant 0,125 M glicino. Visi tolesni veiksmai atlikti 48 ° c temperatūroje. Visi buferiai buvo iš anksto atšaldyti ir esančius proteazės inhibitoriai (Complete mini, Roche). Ląstelės buvo plaunamos du kartus su PBS ir tada pavogta. Surinktos granulės buvo ištirpintos 1 ml lizės buferyje (1% SDS, 5 mM EDTA, 50 mM tris pH 8) ir buvo Ultragarsas šalto etanolio vonioje 10 ciklų esant 100% amplitudei naudojant UP50H išsklaidydami (Hielscher, Teltow, Vokietija). Chromatin fragmentacija buvo vizualizuota 1% agarozės gelio. Gauti fragmentai buvo 200 – 500pb diapazone. Tirpus chromatas buvo gautas centrifuguojant sunaikintos Ultragarsas mėginius 14 000g temperatūroje 10 min 48 ° c temperatūroje. Tirpioji frakcija buvo praskiesta 1/10 skiedimo buferiniame tirpale (1% Triton X-100, 2 mM EDTA, 20 mM tris pH 8, 150 mM NaCl), tada yra alicituota ir laikoma 80 ° c temperatūroje iki naudojimo. (Rodriguez et al. 2008)

Įrenginio Galia [W] Tipas Tūris [mL]
VialTweeter 200 Atskiras 05. 1,5
UP50H 50 Rankinis arba tvirtinamas 0.01 250
UP100H 100 Rankinis arba tvirtinamas 0.01 500
UP200Ht 200 Rankinis arba tvirtinamas 01. 1000
UP200St 200 pritvirtintas prie 01. 1000
UP400St 400 pritvirtintas prie 5,0 2000
Į CupHorn 200 , Didžioji sonorektorius 10 200
GDmini2 200 užterštumas be srautas mobiliojo

Informacijos užklausa




Atkreipkite dėmesį į mūsų Privatumo politika.


Hielscher's VialTweeter is is´deal for the simultaneous preparation of multiple samples

VialTweeter Ultragarso mėginio prep

Susisiekite su mumis! / Klausk mus!

Klauskite daugiau informacijos

Jei norite paprašyti papildomos informacijos apie ultragarso homogenizavimą, naudokite žemiau esančią formą. Mums bus malonu pasiūlyti ultragarso sistemą, atitinkančią jūsų reikalavimus.









Atkreipkite dėmesį, kad mūsų Privatumo politika.


Literatūra / Literatūra

  • Basselet P., Wegrzyn G., Enfors S.-O., Gabig-Ciminska M. (2008): mėginių apdorojimas DNR lusto masyve analize pagrįsta Enterohemoraginės Escherichia coli (EHEC) analizė. Mikrobų ląstelių gamyklos 7:29. 2008.
  • Doublier S., Riganti CH., Voena C., Costamagna C., Aldieri E., Pescarmona G., Ghigo D., Bosia A. (008): RhoA Duslinimas Reverts atsparumas doksorubicino žmogaus gaubtinės žarnos vėžio ląstelių. Molekulinės vėžio tyrimų 6 (10), 2008.
  • Fredlund E., Gidlund A., Olsen M., Börjesson T., Spliid N.H.H., Simonsson M. (2008): būdas įvertinti Fusarium DNR ekstrahavimą iš Mycelia ir kviečių, siekiant nustatyti realiojo laiko PGR kiekybinį įvertinimą ir koreliaciją su mikotoksinų koncentracija. Mikrobiologinių metodų leidinys 2008.
  • Fritsche C., Sitz M., Weiland N., Breitling R., Pohl H.-D. (2007): Leishmania tarentolae augimo elgsenos apibūdinimas – nauja rekombinantinių baltymų ekspresijos sistema. Leidinys pagrindinio mikrobiologijos 47, 2007. 384 – 393.
  • Ristola M., Arpiainen S., Saleem M. A., Mathieson P. W., Velso G. I., Lehtonen S., Holthöfer o. (2009): reguliavimas Neph3 genų podocytes-pagrindiniai vaidmenys transkripcijos veiksniai NF-κB ir SP1. BMC Molekulinė biologija 10:83, 2009.
  • Rodriguez J., Vives L., jorda M., Morales C., Munoz M., Vendrell E., Peinado M. A. (2008): genomo pločio stebėjimas nemetilintų DNR Alu pakartoja normalių ir vėžinių ląstelių. Nukleino rūgščių tyrimų Vol. 36, No 3, 2008. 770-784.
  • Weiske J. Huber O. (2006): histidino triados baltymų Hint1 įjungia apoptozę nepriklausomas nuo jo fermentinis veikla. Biologinės chemijos leidinys. Vol. 281, No. 37, 2006. 27356–27366.


Faktai verta žinoti

Ultragarso/Akustinė kavitacija sukuria labai intensyvus pajėgas, kurios skatina kristalizacijos ir kritulių procesai (paspauskite, Norėdami padidinti!)

Ultragarso DNR kirpimo yra pagrįstas akustinės išsiplėtimą ir jos hidrodinaminis šlyties jėgų