បច្ចេកវិទ្យាអ៊ុលត្រាសោនហេលស៊ឺរ។

ultrasonic Lysis នៃ E. Coli

  • បាក់តេរី E. coli គឺជាបាក់តេរីដែលគេប្រើច្រើនជាងគេបំផុតនៅក្នុងមីក្រូជីវសាស្រ្តនិងជីវបច្ចេកវិទ្យា។
  • អ្នករំខានកោសិកា Ultrasonic ផ្តល់នូវលទ្ធផលដែលអាចទុកចិត្តបាននិងអាចបន្តពូជបានសម្រាប់ការបែងចែកមេរោគនៃវីរុស E. coli ។
  • កំលាំង cavitation ដ៏ខ្លាំងក្លានៅឡើយទេតែអាចកាត់ផ្តាច់ពេញលេញនិងទិន្នផលខ្ពស់ (ឧទាហរណ៍ប្រូតេអ៊ីន DNA) ។

ការរំខានកោសិកាដោយ Cavitation

បាក់តេរី Escherichia coli ត្រូវបាន lysed អាចជឿទុកចិត្តបានដោយប្រើភាគល្អិតជាលិកា ultrasonic ។ប្រភេទ homogenizers ស៊ើបអង្កេត ultrasonic តិបត្តិការជាមួយនឹងការប្រហាក់ប្រហែល។ 20,000 វដ្តក្នុងមួយវិនាទី (នៅ 20kHz) និងបណ្តាលឱ្យ cavitation ក្នុងរាវឬ supsensions ។ តំបន់ cavitation សូរស័ព្ទនៃមីក្រូទស្សន៍នៃសម្ពាធដូចជាបូមធូលីនិងសីតុណ្ហភាពខ្ពស់ដែលកោសិកាដាច់ឡែក។ ថ្វីបើសីតុណ្ហភាពអាចឈានទៅដល់រាប់ពាន់អង្សាសេក៏ដោយបរិមាណ cavitation មានទំហំតូចដូច្នេះពួកគេមិនធ្វើឱ្យដំណើរការនេះមានដំណើរការយ៉ាងខ្លាំងនោះទេ។ អ៊ុលត្រាសោនបានបង្កើត cavitation សូរស័ព្ទនិងកងកម្លាំងកាត់កាត់ឬបំបែកភ្នាសកោសិកាអេលីខូលី – អាស្រ័យលើការកំណត់ឧបករណ៍នៃសភាគ ultrasonic ។

គុណសម្បត្តិនៃការ Ultrasonic Lysis

  • ការត្រួតពិនិត្យច្បាស់លាស់នៃការជ្រុះ (អាំងតង់ស៊ីតេ, ទំហំ, សីតុណ្ហភាព)
  • ការសម្របសម្រួលល្អបំផុតចំពោះសំណាកជាក់លាក់
  • ការគ្រប់គ្រងសីតុណ្ហភាព
  • សម្រ្រប់សំណាកខា្ល្រំងណាស់ទៅតូច (ក្រាមលីត្រដល់លីត្រ)
  • ការព្យាបាលមេកានិចសុទ្ធ
  • ការធ្វើមាត្រដ្ឋានលីនេអ៊ែរពីមន្ទីរពិសោធន៍ទៅជាផលិតកម្ម
ឧបករណ៍ ultrasonic VialTweeter អនុញ្ញាតឱ្យរៀបចំជាបន្តបន្ទាប់គំរូនៃការឡើងទៅ 10 ចានក្រោមលក្ខខណ្ឌដំណើរការដូចគ្នា។ (ចុចដើម្បីពង្រីក!)

VialTweeter សម្រាប់ lysis ultrasonic

ស្នើសុំព




ចំណាំរបស់យើង គោលការណ៍​ភាព​ឯកជន


ខណៈពេលដែលសារធាតុគីមីនិងអេកូអេមិចស៊ីនអាចមានបញ្ហា – ចាប់តាំងពីសារធាតុគីមីអាចផ្លាស់ប្តូររចនាសម្ព័ន្ធប្រូតេអ៊ីននិងណែនាំបញ្ហាការបន្សុតនិងការជ្រលក់អង់ស៊ីមដែលត្រូវការពេលវេលានៃការញាស់យូរនិងមិនអាចបន្តពូជបាន។ – ការរំខាន ultrasonic គឺជាវិធីសាស្រ្តរំខានយ៉ាងឆាប់រហ័សកោសិកាលឿន។
ឡៃស៊ីសឡាស៊ែរផ្អែកលើកម្លាំងមេកានិចតែប៉ុណ្ណោះ។ មិនមានសារធាតុគីមីត្រូវបានបន្ថែមទេការ sonication បំបែកជញ្ជាំងកោសិកាដោយកម្លាំងកាត់។ លីហ្ស៊ីគីមីអាចផ្លាស់ប្តូររចនាសម្ព័ន្ធប្រូតេអ៊ីននិងណែនាំបញ្ហាបន្សុត។ ការរអាក់រអួលអង់ស៊ីមតម្រូវឱ្យមានរយៈពេល incubation រយៈពេលយូរនិងមិនអាចបង្កើតឡើងវិញបាន។ ការរំខានកោសិកា ultrasonic នៃកោសិកាបាក់តេរី E.coli គឺលឿនសាមញ្ញអាចទុកចិត្តបាននិងអាចបង្កើតឡើងវិញបាន។ នោះហើយជាមូលហេតុដែល ultrasonic Hielscher ត្រូវបានប្រើនៅក្នុងមន្ទីរពិសោធន៍ជីវសាស្រ្តនិងជីវគីមីនៅជុំវិញពិភពលោកសម្រាប់ការរៀបចំគំរូគំរូមុន ananlytics ការបង្ហាញនៅក្នុងវិជ្ជជីវាណូនិងការធ្វើកោសល្យវិច័យ។

អនុសាសន៍ទូទៅ

UP400St ultrasonic ជាមួយ reactor លំហូរSonication គឺជាបច្ចេកទេសដ៏ពេញនិយមបំផុតសម្រាប់ lysing បរិមាណតូចណាស់, មធ្យមនិងធំនៃការព្យួរកោសិកា – ពី pico លីត្ររហូតដល់ទៅ 100L / h (ដោយប្រើកោសិកាលំហូរ ultrasonic មួយ) ។ ក្រឡាត្រូវបាន lysed ដោយកាត់ធូលីនិង cavitation ។ ឌីអិនអេក៏ត្រូវបានកាត់បន្ថយក្នុងអំឡុងពេលការ sonication ដូច្នេះវាមិនចាំបាច់បន្ថែម DNase ទៅនឹងការព្យួរកោសិកា។
ការគ្រប់គ្រងសីតុណ្ហភាព:
ដោយធ្វើត្រជាក់មុនគំរូនិងរក្សាគំរូក្នុងអំឡុងពេល sonication នៅលើទឹកកកសំណាកគំរូនៃការរិចរិលនៃគំរូអាចត្រូវបានការពារបានយ៉ាងងាយស្រួល។
តាមឧត្ដមគតិគំរូត្រូវរក្សាទុកទឹកកកត្រជាក់ក្នុងកំឡុងពេលមានជម្ងឺឆ្លងប៉ុន្តែចំពោះគំរូភាគច្រើនវាគ្រប់គ្រាន់ប្រសិនបើសីតុណ្ហភាពមិនឡើងខ្ពស់លើសសីតុណ្ហភាពនៃវប្បធម៌ឬប្រភពជាលិកា។ ដូច្នេះវាត្រូវបានផ្ដល់អនុសាសន៍, ដើម្បីរក្សាការផ្អាកនៅលើទឹកកកនិងដើម្បី sonicate ជាមួយនឹងការនាំយក ultrasonics ខ្លីរយៈពេល 5-10 នៃរយៈពេលនិងរយៈពេល 10-30 វិ។ កំឡុងពេលផ្អាកកំដៅអាចកំដៅដើម្បីកំដៅឡើងវិញ។ សម្រាប់សំណាកកោសិកាធំ ៗ មានរ៉េអាក់ទ័រកោសិកាលំហូរជាច្រើនដែលមានអាវត្រជាក់។

ពិធីសារសម្រាប់ការរៀបចំអ៊ីលីលីលីលីតសាឌី

ការវិភាគចំណេះដឹងនិងការបន្សុទ្ធនៃប្រូតេអ៊ីន recombinant

ដុំគ្រាប់ E. coli ត្រូវបាន sonicated ជាមួយប្រព័ន្ធ ultrasonic មួយ UP100H (Hielscher) ។ ចំពោះគោលបំណងនេះគ្រាប់ក្រឡាត្រូវបានបញ្ចូលក្នុងសតិបណ្តោះអាសន្នញាក់ (50 mM Tris-HCl pH = 7.5, NaCl 100 mM, 5 mM DTT, 1 mM PMSF) និងត្រជាក់លើទឹកកកអស់រយៈពេល 10 នាទី។ បន្ទាប់មកការព្យួរកោសិកាត្រូវបាន sonicated ជាមួយ 10 រលាយខ្លីនៃ 10 s បានបន្តដោយចន្លោះពេល 30 s សម្រាប់ការត្រជាក់។ ចុងបញ្ចប់កោសិកាកំទេចកោសិកាត្រូវបានយកចេញដោយ ultracentrifugation នៅសីតុណ្ហភាព 4 អង្សាសេរយៈពេល 15 នាទីនៅឯ 14000 rpm ។ ចំពោះការអះអាងនៃការបញ្ចេញ RPR, supernatant ត្រូវបានដំណើរការលើសារធាតុ gel polyacrylamide 12% និងវិភាគដោយ SDS-PAGE និងបូសបូទី។ ការលាងសម្អាត RPR ត្រូវបានធ្វើដោយប្រើ Ni2+- ជ័រ NTA (Invitrogen, សហរដ្ឋអាមេរិក) យោងតាមការណែនាំរបស់អ្នកផលិត។ នៅដំណាក់កាលនេះវិធីសាស្ត្របន្សុតត្រូវបានគេប្រើ។ ភាពបរិសុទ្ធនៃប្រូតេអ៊ីនដែលត្រូវបានបន្សុតត្រូវបានគេប៉ាន់ស្មានដោយប្រើអេឡិត្រូផូរីសនៅលើជ័រប្រូតេអ៊ីន Polyacrylamide 12% និងថ្នាំខៀវ Coomassie ។ កំហាប់ប្រូតេអ៊ីនដែលត្រូវបានលាងសម្អាតត្រូវបានវាស់ដោយឧបករណ៍ពិសោធន៍ប្រូតេអ៊ីនខ្នាតតូច Micro BCA (PIERCE, USA) ។ (Azarnezhad et al ។ , 2016)

គ្រឿងរំខានកោសិកា Ultrasonic UP100H (100W) សម្រាប់ការបែងចែក, ការរំខានកោសិកានិង DNA កាត់។

សភាគ ultrasonic UP100H (100 វ៉ាត់)

ការលូតលាស់កោសិការឆ្លងកាត់និងការរៀបចំចំរាញ់នៃមេរោគ E. coli

សម្រាប់ SeqA និង RNA polymerase Chip-Chip E. coli MG1655 ឬ MG1655 ΔseqAត្រូវបានគេដាំដុះនៅ 37 ° C ទៅជាស្រុកប្រតិបត្តិមួយ600 ប្រហែល 0,15 ក្នុង 50 មីលីលីត្រ LB (+ 0,2% នៃជាតិគ្លុកកូស) មុនពេលត្រូវបានបន្ថែម (27%) នៃសារធាតុ formaldehyde (37%) ក្នុងមួយមីលីលីត្រ (កំហាប់ចុងក្រោយ 1%) ។ ការឆ្លងកាត់ត្រូវបានធ្វើឡើងនៅពេលញ័រយឺត (100 ជុំ / នាទី) នៅសីតុណ្ហភាពក្នុងបន្ទប់ 20 នាទីបន្ទាប់មកដោយការពន្លត់ជាមួយមីលីស្ទីន 2.5 មីលីលីត្រ 10 មីលីលីត្រ (កំហាប់ចុងក្រោយ 0.5 មីលីម៉ែត្រ) ។ ចំពោះការពិសោធដោយកំដៅឆក់ E. coli MG1655 ត្រូវបានគេដាំដុះក្នុងមធ្យម 65 មីលីលីត្រ LB នៅសីតុណ្ហភាព 30 អង្សាសេទៅស្រុកប្រតិបត្តិ។600 ប្រហែល 0,3 ។ បន្ទាប់មក 30 មីលីលីត្រនៃវប្បធម៌ត្រូវបានគេបញ្ជូនទៅដបកក់ក្តៅមុននៅសីតុណ្ហភាព 43 អង្សាសេហើយនៅសល់ត្រូវបានរក្សានៅសីតុណ្ហភាព 30 អង្សាសេ។ ការឆ្លងកាត់និងការពន្លត់ភ្លើងគឺដូចបានរៀបរាប់ខាងលើលើកលែងតែកោសិកាត្រូវបានគេរក្សានៅសីតុណ្ហភាព 30 ឬ 43 អង្សាសេក្នុងរយៈពេល 5 នាទីមុនពេលញ័រយឺតនៅសីតុណ្ហភាពបន្ទប់។ កោសិកាត្រូវបានគេប្រមូលដោយ centrifugation និងលាងទ្វេដងជាមួយជំងឺ TBS ត្រជាក់ (pH7.5) ។ បន្ទាប់ពីការរឹតបន្តឹងក្នុងអង្គធាតុរាវលីនីស 1 មីលីលីត្រ (10 មីលីម៉្តត្រូនីធីត្រូម៉ាស 10 មីលីលីត្រលីត្រ 50 មីលាតត្រីលីត្រ 10 មីលីលីត្រលីសូស៊ីម 10 មីលីក្រាម / លីណូហ្ស៊ីម 10 មីលីលីត្រ) និងការកកិតនៅ 37 អង្សាសេសម្រាប់រយៈពេល 30 នាទី។ សតិបណ្ដោះអាសន្ន, កោសិកាត្រូវបាន sonicated លើទឹកកកជាមួយ 12 ដង 30 វិនាទីនិង 30 វិនាទីដាច់នៅមួយ UP400St ដំណើរការ ultrasonic (Hielscher Ultrasonics GmbH) ជាមួយថាមពល 100% ។ បន្ទាប់ពីការ centrifugation សម្រាប់ 10 នាទីនៅ 9000 ក្រាម, 800 លីត្រ aliquotes នៃ supernatant ត្រូវបានរក្សាទុកនៅ -20 អង្សាសេ។ (Waldminghaus 2010)

ការផលិតនិងការបន្សុតនៃអង់ស៊ីម។

ចំពោះការផលិតប្រូតេអ៊ីន decahistidine (His10) ដែលត្រូវបានកែច្នៃនោះ E. coli BL21 (DE3) ត្រូវបានផ្លាស់ប្តូរជាមួយសំណង់ pET19b ។ ការហូបចុកនៅពេលយប់ត្រូវបានប្រមូលដោយការប្រមូលផ្តុំ centrifugation និង 1% ត្រូវបានប្រើដើម្បីបញ្ចូលវប្បធម៌កន្សោមមួយ។ កោសិកាដឹកជញ្ជូន pET19mgtB ត្រូវបានគេដាំនៅសីតុណ្ហភាព 22 អង្សាររហូតដល់ដង់ស៊ីតេអុបទិក 600 nm (OD600) នៃ 0,7 ។ វប្បធម៌ត្រូវបានផ្ទេរទៅ 17 អង្សាសេហើយបណ្តាលមកពី IPTG 100 μM។ បន្ទាប់ពី 16 ម៉ោងវប្បធម៌ត្រូវបានប្រមូលដោយ centrifugation នៅ 7.500 × g នៅ 4 ° C ។ កោសិកាត្រូវបានគេបញ្ចូលក្នុងប្រូតេអ៊ីនប្រូតេអ៊ីនប្រូតេអ៊ីនប្រូតេអ៊ីន (PBS) 50 មីលីម៉ែតជាមួយប្រូតេអ៊ីន NaCl 0,3 M នៅ pH 7.4 និងរំខានដោយ ultrasonication ជាមួយ sonotrode S2 micro-tip UP200St ultrasonicator (Hielscher, Teltow ប្រទេសអាល្លឺម៉ង់) នៅវដ្តនៃការ 0.5 និងទំហំនៃការមួយ 75% ។
ការផលិតហួសប្រមាណរបស់ GtfC ដែលត្រូវបានដាក់ឈ្មោះថា decahistidine ត្រូវបានបង្កឡើងនៅ 37 អង្សាសេនៅឯស្រុកប្រតិបត្តិមួយ600 នៃ 0.6 ជាមួយ IPTG 100 μM។ កោសិកាទាំងនោះត្រូវបានចាក់ថ្នាំអស់រយៈពេល 4 ម៉ោង, ប្រមូលផលនិងហៀរដូចដែលបានបញ្ជាក់ខាងលើសម្រាប់ MgtB ។
ការដកស្រង់កោសិកាឆៅត្រូវបានគេប្រមូលផ្តុំដោយផ្ចិតផ្ចង់នៅចន្លោះ 15 000 ×ក្រាមនិង 4 អង្សាសេដើម្បីរំលាយកំទេចកោសិកា។ សារធាតុចម្រាញ់ដែលបានបញ្ជាក់ត្រូវបានផ្ទុកនៅលើជួរឈរ Crude HisTrap FF 1 មីលីម៉ែត្រដោយប្រើប្រាស់ប្រព័ន្ធÄKTAprime Plus (GE Healthcare) ។ អង់ហ្ស៊ីមត្រូវបានគេបោសសម្អាតដោយយោងតាមពិធីសាររបស់អ្នកផលិតសម្រាប់ការលាងសម្អាតប្រូតេអ៊ីនរបស់ទ្រង់។ ដំណោះស្រាយប្រូតេអ៊ីនដែលបានលុបចោលត្រូវបានគេ dialyzed ពីរដងធៀបនឹង 1,000 volumes នៃ PBS 50 mM, pH 7.4, ជាមួយ NaCl 0,3 M នៅ 4 ° C ។ ការធ្វើអនាម័យត្រូវបានវិភាគដោយ 12% SDS-PAGE ។ ការប្រមូលផ្តុំប្រូតេអ៊ីនត្រូវបានកំណត់ដោយវិធីសាស្ត្រ Bradford ដោយប្រើប្រាស់ Roti-Quant (Carl Roth GmbH, Karlsruhe ប្រទេសអាឡឺម៉ង់) ។ (Rabausch et al 2013)

ការស្រង់នៃប្រូតេអ៊ីនពីបាក់តេរី E. coli
ប្រូតេអ៊ីននុយក្លេអ៊ែរដែលមានចំណាប់អារម្មណ៍ (ក្នុងករណីនេះ MTV1 នៃ Arabidopsis thaliana) ត្រូវបានបញ្ចូលគ្នាទៅនឹងស្លាក GST និងត្រូវបានបង្ហាញនៅក្នុងកោសិកា Escherichia coli (E. coli) BL21 ។
យកបន្ទះមួយនៃ GST-MTV1 និង GST (ដែលត្រូវគ្នាទៅនឹងវប្បធម៌បាក់តេរី 50 មីលីលីត្រ) ហើយដាក់នៅក្នុងស្រោមសាប៊ូត្រជាក់ដែលមានទឹកកក 2.5 មីលីលីត្រ។
ប្រើអេឡិចត្រូនិច UP100H (បំពាក់ដោយ microtip sonotrode MS3 សម្រាប់ទំហំតូច (2-5 មល)) ដើម្បីរំខានដល់កោសិកាបាក់តេរីរហូតដល់ពួកគេត្រូវបាន lysed ដែលត្រូវបានចង្អុលបង្ហាញដោយភាពស្រអាប់ថយចុះនិងការកើនឡើង viscosity ។ នេះត្រូវបានអនុវត្តនៅលើទឹកកកហើយវាត្រូវបានផ្ដល់អនុសាសន៍ឱ្យ sonicate ក្នុងចន្លោះពេល (ឧ។ 10 sec sonicating បន្តដោយ 10 វិនាទីនៅលើទឹកកកនិងដូច្នេះនៅលើ) ។ ការថែទាំត្រូវបានយកមិនឱ្យ sonicate ជាមួយអាំងតង់ស៊ីតេខ្ពស់ពេក។ ប្រសិនបើត្រូវបានរកឃើញភាពល្មមឬការបង្កើតប្រតិកម្មពណ៌សកម្រិតអាំងតង់ស៊ីតេត្រូវបានបន្ទាប។
3. ផ្ទេរដំណោះស្រាយបាក់តេរីរាវដើម្បីបំពង់ microcentrifuge 1.5 មីលីលីត្រនិង centrifuge នៅ 4 ° C, 16.000 XG សម្រាប់ 20 នាទី។

ប្រូតេអ៊ីនដែលបានកែច្នៃអាល់លីលីនក្នុង E. coli

VialTweeter គឺជា ultrasonicator មានផាសុខភាពសម្រាប់ homogeneous គំរូតូចការប្តេជ្ញាចិត្តនៃសារធាតុសូលុយស្យេទឹកក្នុងបរិមាណអាស៊ីត 5,5 អាន់ឌ័រ (ឌីតឌីណូប៊ីស្យូម) (2-nitrobenzoic acid) (DTNB)
វប្បធម៌អ៊ីយ៉ូដ E. coli MG1655 ត្រូវបានប្រើដើម្បីបញ្ចូល MOPS តិចបំផុត (1: 100) ។ វប្បធម៌នេះត្រូវបានគេដាំដុះតាមអេកូរហូតដល់ A600 នៃ 0.4 ត្រូវបានឈានដល់។ វប្បធម៌នេះត្រូវបានបំបែកទៅជា 3 វណ្ណៈ 15 មីលីលីត្រសម្រាប់ការព្យាបាលស្ត្រេស។ វប្បធម៌មិនបានព្យាបាលជាការត្រួតពិនិត្យអវិជ្ជមាន។ 0,79 មីលីលីត្រមីលីលីន (128 មីលីក្រាម-1) ឬ 1 មីលីម៉ែតមីលីម៉ែត្រត្រូវបានបន្ថែមទៅមួយនៃវប្បធម៌ដែលនៅសល់ពីរ។ វប្បធម៌ត្រូវបានបង្កាត់ក្នុងរយៈពេល 15 នាទី។ 5 មីលីលីត្រនៃដំណាំនីមួយៗត្រូវបានគេប្រមូលផ្ដុំដោយ centrifugation (8.525 × g, 4 ° C, 10 នាទី) ។ កោសិកាត្រូវបានគេសំអាតពីរដងជាមួយ PBS 1 មីលីលីត្រ (NaCl 137 មីល, 2,7 មីលីម KCl, 10 មីលីម៉ែតម៉ាម2HPO4, 2 mM KH2PO4, pH 7.4, ត្រូវបានរក្សាទុក anaerobically មុនពេលប្រើ) និង centrifuged (13.000 × g, 4 ° C, 10 នាទី) ។ កោសិកាត្រូវបានគេដាក់បញ្ចូលក្នុងសតិបណ្ដោះអាសន្ន (PBS ជាមួយនឹងហ្គាណូឌីនីញ៉ូម HCl 6 មីលីម៉ែត pH 7.4) មុនពេលការរំខាននៅសីតុណ្ហភាព 4 អង្សាសេតាមរយៈការធ្វើ ultrasonication (VialTweeter ultrasonicator, Hielscher GmbH, ប្រទេសអាល្លឺម៉ង់) (3 × 1 នាទី) ។ កំទិចកំទិចកំទិចកោសិកាត្រូវបានកប់ដោយការកណ្តាល (13.000 × g, 4 ° C, 15 នាទី) ។ អាត្ម័នត្រូវបានបញ្ជូនទៅកញ្ជក់ QS-macro cuvette 3,5 មីលីលីត្រ (10 មីលីម៉ែត្រ) ជាមួយរបារកូរម៉ាញ៉េទិចនិងលាយជាមួយសូលុយស្យុងលីនីស 1 មីលីលីត្រ។ ការផុតពូជនៃសំណាកត្រូវបានត្រួតពិនិត្យនៅឯ 412 nm ជាមួយ Jasco V-650 spectrophotometer បំពាក់ជាមួយ PSC -718 ឧបករណ៍ផ្ទុកសីតុណ្ហភាពគ្រប់គ្រង (Jasco) នៅសីតុណ្ហភាពបន្ទប់។ គេបានបន្ថែមដំណោះស្រាយ 100 មីលីលីត្រមួយនៃដំណោះស្រាយអាស៊ីតឌីអុកស៊ីត 3 មីលីម៉ែត្រ (ឌីអ័រប៊ីនហ្សូអឹស) ។ ការឃ្លាតឆ្ងាយត្រូវបានត្រួតពិនិត្យរហូតដល់វាមានភាពរលោង។ ការគណនានៃការប្រមូលផ្តុំ thiol ត្រូវបានអនុវត្តដោយប្រើមេគុណរលកធាតុអាកាសε412 = 13,700 ម៉ែ-1 សង់​ទី​ម៉ែ​ត-1 សម្រាប់ទឹកអាស៊ីត thio-nitrobenzoic (TNB) ។ កំហាប់ thiol កោសិកាត្រូវបានគេគណនាដោយផ្អែកលើបរិមាណនៃកោសិកា E. coli នៃ 6.7 × 10-15 លីត្រនិងដង់ស៊ីតេក្រឡា A600 = 0.5 (ស្មើនឹង 1 × 108 កោសិកា ml-1 វប្បធម៌) ។ (Müller et al ។ , 2016)

ការវាយតម្លៃនៅក្នុងវីវូហ្គូថិនថិន

E.coli MG1655 ត្រូវបានគេដាំដុះក្នុង MOPS តិចតួចបំផុតក្នុងបរិមាណសរុប 200 មីលីលីត្ររហូតដល់មួយ600 នៃចំនួន 0.5 ត្រូវបានឈានដល់។ វប្បធម៌ត្រូវបានបំបែកទៅជាវប្បធម៌ 50 មីលីលីត្រសម្រាប់ការព្យាបាលស្ត្រេស។ បន្ទាប់ពីញាស់ 15 នាទីជាមួយនឹងសារធាតុ Allicin 0,79 មីលីម៉ែត្រអំបិល 1 មីលីម៉ែត្រឬឌីអេហ្វអេសស៊ីហ្វូអ៊ីតត្យូម (កោសិកា) ត្រូវបានប្រមូលផលបាន 4,000 ក្រាមនៅសីតុណ្ហភាព 4 អង្សាសេរយៈពេល 10 នាទី។ កោសិកាត្រូវបានគេលាងសំអាតពីរដងជាមួយសតិបណ្តោះអាសន្ន KPE មុនពេលការរឹតបន្តឹងនៃគ្រាប់ខ្លាញ់ក្នុង700μlនៃសូលីត KPE ។ ចំពោះការបង្ការរោគ, 300 លីត្រនៃទឹកអាស៊ីដស៊ុលហ្វាលសាលីកស៊ីល 300 លីត្រ (% / វិ) ត្រូវបានបន្ថែមមុនពេលរំខានដល់កោសិកាដោយការធ្វើអេកូ (3 x 1 នាទី; VialTweeter ultrasonicator) ។ Supernatants ត្រូវបានគេប្រមូលបន្ទាប់ពីការសេនេទិច (30 នាទី 13000 ក្រាមនិង 4 អង្សាសេ) ។ កំហាប់អាស៊ីត Sulfosalicylic ត្រូវបានថយចុះដល់ 1% ដោយការបន្ថែម 3 ប្រភេទនៃសូលីត KPE ។ ការវាស់វែងនៃ glutathione និង GSSG សរុបត្រូវបានអនុវត្តដូចដែលបានរៀបរាប់ខាងលើ។ កំហាប់ glutathione កោសិកាត្រូវបានគណនាដោយផ្អែកលើបរិមាណនៃកោសិកា E. coli នៃ 6.7×10-15 លីត្រនិងដង់ស៊ីតេក្រឡា A600 0.5 (ស្មើនឹង 1×108 កោសិកា ml-1 វប្បធម៌) ។ កំហាប់ GSH ត្រូវបានគេគណនាដោយការដកនៃ 2 [GSSG] ពី glutathione សរុប។ (Müller et al ។ , 2016)

រំខាន ultrasonic សម្រាប់ lysis ក្រឡានិងការទាញយកសម្ភារៈជីវសាស្រ្ត (ចុចដើម្បីពង្រីក!)

ប្រភេទស៊ើបអង្កេតប្រភេទ ultrasonic UP400St

ការបញ្ចេញមតិនៃមនុស្ស mAspAT នៅក្នុង E. coli

គ្រឿងរំខានកោសិកា Ultrasonic UP400St (400W) សម្រាប់ការស្រង់ចេញនៃបញ្ហាខាងក្នុង (ឧ។ ប្រូតេអ៊ីន, organelles, DNA, RNA ជាដើម)អាណានិគមតែមួយនៃ E. coli BL21 (DE3) ដែលផ្ទុកនូវវ៉ិចទ័របញ្ចេញកន្សោមក្នុង 30 មីលីលីត្ររបស់ Luria-Bertani (LB) ដែលមាន ampicillin 100 μg / mL បន្ទាប់មកត្រូវបានគេដាំនៅ 37 អង្សាសេរហូតដល់ដង់ស៊ីតេអុបទិក (OD600) បានឈានដល់ 0.6 ។ កោសិកាទាំងនោះត្រូវបានគេប្រមូលផ្តុំដោយ centrifugation នៅ 4000 ក្រាមក្នុងរយៈពេល 10 នាទីហើយត្រូវបានដាក់ជំនួសវិញក្នុងបរិមាណ LB ស្រស់ 3 លីដែលមាន 100 មីលីក្រាម / មីលីលីត្រ ampicillin ។
បនា្ទាប់មកប្រតិកម្មប្រូតេអ៊ីនត្រូវបានបណ្តាលឱ្យមាន 1 mM isopropyl β-α-1-thiogalactopyopyranoside (IPTG) សម្រាប់រយៈពេល 20 ម៉ោងនៅសីតុណ្ហភាព 16 អង្សាសេ។ កោសិកាត្រូវបានគេប្រមូលផ្ដុំដោយ centrifugation នៅ 8,000 × g ក្នុងរយៈពេល 15 នាទីហើយលាងសម្អាតជាមួយសាប៊ូ A (NaH2PO4 20 មីន, NaCl 0,5 មីលីត្រ, ភីល 7.4) ។ កោសិកាទំងន់ប្រហែល 45 ក្រាម (សើម) ត្រូវបានគេទទួលបានពីវប្បធម៌ 3 លីត្រ។ បន្ទាប់ពីការ centrifugation, pellets កោសិកាត្រូវបាន resuspended ក្នុង 40 មីលីលីត្រ (សម្រាប់វប្បធម៌ 1 លីត្រ) ស្រង់ត្រាប់ទឹកកកត្រជាក់ A, និង lysed ដោយ ultrasonication នៅសីតុណ្ហភាពត្រជាក់ - ទឹកកកដោយប្រើ UP400St ឧបករណ៍ (Dr. Hielscher GmbH, ប្រទេសអាល្លឺម៉ង់) ។ ការលាងកោសិកាត្រូវបានគេប្រមូលផ្តុំនៅឯ 12,000 ជុំ / នាទីក្នុងរយៈពេល 15 នាទីដើម្បីបំបែកសារធាតុដែលរលាយនិងប្រូតេអ៊ីនរលាយ។ (Jiang និងលេខ 2015)

តារាងខាងក្រោមផ្តល់ឱ្យអ្នកនូវការបង្ហាញនៃសមត្ថភាពដំណើរការប្រហាក់ប្រហែលនៃ ultrasonic របស់យើង:

កម្រិតសំឡេងបាច់ អត្រា​លំហូរ ឧបករណ៍ដែលបានផ្ដល់អនុសាសន៍
0.5 ទៅ 1.5mL na VialTweeter
1 ទៅ 500 មល 10 ទៅ 200mL / នាទី UP100H
ពី 10 ទៅ 2000mL 20 ទៅ 400mL / នាទី Uf200 ःមិន,, UP400St
0.1 ទៅ 20 លីត្រ 0.2 ទៅ 4L / នាទី UIP2000hdT
10 ទៅ 100 លីត្រ 2 ទៅ 10 លីត្រ / នាទី UIP4000
na 10 ទៅ 100 លីត្រ / នាទី UIP16000
na ធំជាង ចង្កោម UIP16000

ទាក់ទង​មក​ពួក​យើង! / សួរយើងខ្ញុំ!

សូមប្រើប្រាស់សំណុំបែបបទខាងក្រោមប្រសិនបើអ្នកចង់ស្នើសុំបន្ថែមអំពីការ homogenization ultrasonic ។ យើងនឹងរីករាយក្នុងការផ្តល់ជូនលោកអ្នកនូវប្រព័ន្ធ ultrasonic ការជួបតម្រូវការរបស់អ្នក។









សូមចំណាំរបស់យើង គោលការណ៍​ភាព​ឯកជន


អក្សរសិល្ប៍ / ឯកសារយោង



ហេតុការណ៍តម្លៃដោយដឹងថា

E.coli

Escherichia coli (E. coli) គឺជាក្រពេញអំបិលអ័រអេរ៉ូប៊ីកដែលមានរាងដូចទងផ្ចិតនិងបាក់តេរីនៃពពួក Escherichia ដែលត្រូវបានគេរកឃើញជាទូទៅក្នុងពោះវៀនដែលមានឈាមក្តៅខ្លាំង (endotherms) ។ មានចំនួនច្រើននៃមេរោគ E. coli (ឬប្រភេទរង) ដែលមានលក្ខណៈផ្សេងៗគ្នា។ ភាគច្រើននៃមេរោគ E. coli គឺមិនបង្កគ្រោះថ្នាក់ដល់មនុស្សដូចជាប្រភេទ B និង K-12 ដែលត្រូវបានគេប្រើជាទូទៅសម្រាប់ការស្រាវជ្រាវនៅមន្ទីរពិសោធន៍។ ទោះជាយ៉ាងណាក៏ដោយប្រភេទខ្លះមានគ្រោះថ្នាក់ហើយអាចបង្កឱ្យមានជំងឺធ្ងន់ធ្ងរ។
E. coli ដើរតួនាទីយ៉ាងសំខាន់ក្នុងវិស្វកម្មជីវសាស្រ្តទំនើបនិងមីក្រូជីវសាស្រ្តឧស្សាហកម្មចាប់តាំងពីបាក់តេរីមានភាពងាយស្រួលក្នុងការប្រើ។ កម្មវិធីមន្ទីរពិសោធន៍ទូទៅដែលជាប់ពាក់ព័ន្ធញឹកញាប់ការប្រើប្រាស់ E. coli ឧ។ ដើម្បីបង្កើតអាស៊ីត deoxyribonucleic recombinant (DNA) ឬដើរតួជាសារពាង្គកាយគំរូ។
E. coli គឺជាម៉ាស៊ីនដែលអាចប្រើបានច្រើនសម្រាប់ការផលិតប្រូតេអ៊ីនអ៊ីសូរីយ៉ូហើយប្រព័ន្ធបញ្ចេញប្រូតេអ៊ីន manifold អាចរកបានដើម្បីបង្កើតប្រូតេអ៊ីន recombinant នៅក្នុង E. coli ។ ការប្រើ plasmid ដែលអនុញ្ញាតឱ្យមានការបង្ហាញកម្រិតខ្ពស់នៃប្រូតេអ៊ីនហ្សែនអាចត្រូវបានណែនាំទៅក្នុងបាក់តេរីដែលអាចធ្វើឱ្យផលិតប្រូតេអ៊ីនទាំងនោះមានបរិមាណខ្ពស់ក្នុងដំណើរការផ្សិត។
E.coli ត្រូវបានគេប្រើជារោងចក្រកោសិកាដើម្បីផលិតអាំងស៊ុយលីន។ កម្មវិធីផ្សេងទៀតរួមមានការប្រើប្រាស់កោសិកាអ៊ីប៉ូអ៊ីដែលបានកែច្នៃដើម្បីផលិតនិងផលិតថ្នាំវ៉ាក់សាំងនិងអង់ស៊ីមដែលមិនទាន់បានកំណត់ដើម្បីផលិតជីវឥន្ធនៈព្រមទាំងសម្រាប់ជីវឧស្ម័នផងដែរ។
សំពាធ K-12 គឺជាទម្រង់ដែលមានលក្ខណៈប្រែប្រួលរបស់ E. coli ដែលបង្ហាញពីអង់ស៊ីមអាល់កាលីនផូស្វាតា (ALP) ។ ការផ្លាស់ប្តូរនេះកើតឡើងដោយសារតែភាពមិនប្រក្រតីនៃហ្សែនដែលជានិច្ចកាលដាក់កូដសម្រាប់អង់ស៊ីម។ ប្រសិនបើហ្សែនផលិតនូវផលិតផលដោយគ្មានការទប់ស្កាត់ណាមួយនោះវាត្រូវបានគេស្គាល់ថាជាធាតុផ្សំ។ សំណុំបែបបទប្រែប្រួលជាក់លាក់នេះត្រូវបានប្រើសម្រាប់ឯកោនិងការបន្សុតអង់ស៊ីម ALP ។

ultrasonic DNA បានកាត់

កងកាប់ ultrasonic គឺជាវិធីសាស្រ្តមួយដែលត្រូវបានគេប្រើជាទូទៅដើម្បីបំបែកពីក្រឡាហើយបំបែកខ្សែអេឌីអេនជាបំណែក។ ស៊ីវ៉្រីសសូរស័ព្ទបំបែកកោសិកានិងជញ្ជាំងកោសិកាដើម្បីដកយក DNA ពីកោសិកានិងបង្កើតបំណែកប្រហែល 600 – 800 bp ដែលមានប្រវែងដែលល្អសម្រាប់ការវិភាគ។
សូមចុចនៅទីនេះដើម្បីរៀនបន្ថែមទៀតអំពី homogenizers ultrasonic សម្រាប់បំណែកឌីអិនអេ!