Hielscher ультрадыбыстық технологиясы

Тіндік және жасушалық мәдениеттерден ультрадыбыстық ақуызды алу

  • Ақуызды алу - бұл протеомиктердегі маңызды дайындық қадамы.
  • Ақуыздар өсімдіктер мен жануарлардың тіндерінен, ашытқыларынан және микроорганизмдерден алынуы мүмкін.
  • Ультрадыбыспен - қысқа экстракция уақытында ақуыздың жоғары өнімділігін беретін сенімді, тиімді ақуызды экстракциялау әдісі.

 

Тіндер мен жасушалардан ақуыз алу

Тіндердің және өсірілген жасушалардың протеинді экстракциясы - көптеген биохимиялық және аналитикалық әдістемелерде, мысалы, ELISA, PAGE, Western blotting, масс-спектрометрия немесе ақуызды тазарту. Ультрадыбыстық жасуша бұзылуы, лизис және экстракция протеиндердің жоғары өнімділігін қамтамасыз ететін нақты бақыланатын әдіс.

Жануарлар тінінен ақуызды алу

Толық көлемді ұлпаны (мысалы, бүйрек, жүрек, өкпе, бұлшықет т.с.с.) дайындау үшін тіндерді таза құралдармен кішкене бөліктерге бөліп, мүмкіндігінше мұз үстіне қою керек және протеаздармен деградацияны болдырмау үшін мүмкіндігінше тезірек салу керек (мысалы, мысалы, RIPA немесе гипотоникалық лизис буфері бар протеаз және фосфатаза ингибиторы коктейлі). Бөлінгеннен кейін сынама тез мұздату үшін сұйық азотқа батырылады. Үлгіні кейін пайдалану үшін -80 ° C температурада сақтауға немесе бірден гомогенизациялау үшін мұзға батыруға болады. Ультрадыбыстық экстракциядан бұрын мұздатылған мұзды лизис буферін (протеаз ингибиторлары бар DTT, леупептин және абротинин) сынама түтігіне тез қосады (~ 10 мг тінге шамамен ~ 600 мкл буфер ұсынылады). Шамамен. Түтікшеге 20-60 мг ұлпа ұсынылады.
Ультрадыбыстық гомогенизация, лизис және экстракция сияқты ультрадыбыстық гомогенизатормен орындалады Uf200 ः T немесе UP200St, микро-ұштығы бар sonotrode жабдықталған. Sonication ұзақтығы 60-90 сек. ультрадыбыстық цикл режимінде 15 секунд. sonication және 10 сек. демалыс уақыты. Сынаманы мұз әрқашан ұстау керек.
Ультрадыбыстық гомогенизациядан / экстракциядан кейін, лизат шамамен 27 000 г-да центрифугаланған. 20 мин. Содан кейін ақуыздың концентрациясы Пирстер протеинінің BCA анализі сияқты ақуыздың талдауы арқылы анықталуы мүмкін.

Протеин ультрадыбысы - бұл сынаманы дайындаудың маңызды әдісі

Жасушадан ультрадыбыстық ақуыз алу UP200St

Ақпараттық сұрау




Біздің ескеріңіз құпиялылық саясаты.


Қан сарысуынан ақуызды алу

Сарысудың біртекті қоспасы мен фосфатты буфер үшін ультрадыбыстық жасуша лизисінен бұрын бірінші үлгі құйылады. Ультрадыбыстық лизис үшін сынама ультрадыбысты зертханалық гомогенизатормен ультрадыбысқан UP100H 8 цикл үшін 20% амплитудасы, әр 5 секунд циклдары үшін және 15 секунд өшіру. Сонокация ультрадыбыспен циклдар арқылы жүзеге асырылады және үлгіні қызып кету мен термиялық ыдырауға жол бермеу үшін мұз үстіне қою арқылы жүзеге асырылады. ІЭФ кезінде төмен молекулалық салмақ белоктарының бөлінуіне кедергі келтіретін жоғары молекулалық салмақ белоктары (альбумин, α1-антиприпсина, трансферрин, гаптоглобулин, иммуноглобулин G және иммуноглобулин А) көп болғандықтан, сарысуда оларды сарқылу ұсынылады сарысудан сарқылу бағанымен.

Өсімдік тінінен ақуызды алу

Жаңа, жұмсақ өсімдік тіндері, мысалы, мүк және т.б., ультрадыбыспен жұқартуға арналған кесілген материалды лизис буферіне қою арқылы оңай бұзылуы мүмкін. Өсімдіктің қатты, тіндері, мысалы, тұқымдар, шырша инелері және т.б. құрғақ болуы керек. Ультрадыбыспен алынғанға дейін кейбір қатты, ағаш өсімдік материалдары мұздатылып, сұйық азотқа түсуі керек. Өсімдіктің жасушалық культурасын суспензиялау үшін лизис буферінде 30-дан 150 секундқа дейінгі ультрадыбыстық емдеу жеткілікті. Асқабақ тұқымы сияқты қатаң материал төменде сипатталғандай, қарқынды ультрадыбыспен талап етеді.

Асқабақ тұқымдарынан альбуминді ультрадыбыстық өндіруге арналған протокол

Ультрадыбыстық тіндердің гомогенизаторы UP400St S24d40 бастап - өсімдік және жануарлардан алынған протеинді алу үшін (үлкейту үшін басыңыз!)250 мкл шыны ыдыста ерітінді ретінде ұсақ жер асқабақ тұқым ұнтағынан альбумин ультрадыбыстық ақуызды алу, 10 г дефектирленген асқабақ тұқым ұнтағы және 100 мл деионизацияланған су қосылады. Протеин экстракциясы екі кезеңнен тұрады: Біріншіден, сынама түрінде ультрадыбыстық зондпен түрлендіріледі UP400St (400W, 24kHz) S24d7 орнатылған sonotrode бар. Шыны стакан ультрадыбыстық гомогенизация кезінде суық су ваннасына орналастырылған. Ultrasonicator параметрі UP400St Қосылатын температура сенсоры үлгі температурасының әрдайым 30 ° C-тан төмен деңгейде сақталуын қамтамасыз етеді. Ультрадыбыспен температураны дәл бақылау арқылы альбуминді денатурациялауға жол берілмейді. Екіншіден, экстракция 200 айн / мин жылдамдықпен және 30 ° С кезінде миксермен өткізілді. Содан кейін стакан термостатикалық шайқауға ауысады. Глобулин дистилляцияланған сумен диализ арқылы жойылады. Глобулинді алып тастағаннан кейін белок сығындысын альбумин профилін анықтау үшін іріктеп алуға болады және одан кейін альбинококуляризация үшін 0,1 М HCl арқылы pI = 3.0-ге теңшеленеді. Қатты фаза центрифугалаумен 5000 г, 20 ° C температурада бөлінеді және деионизацияланған сумен қайтадан ажыратылады. Альбумин коагуляциясы альбумин концентрациясында белок қатынасын арттыру үшін екі рет орындалады.

Күріштен алынған ақуыз концентратын дайындау үшін ультрадыбыстық сілтілі ақуызды экстракция ультрадыбыстық емдеу едәуір қысқа экстракция уақытында жоғары ақуыздың шығуына әкеледі – экстракцияның әдеттегі әдістерімен салыстырғанда.

Ультрадыбыстық құрылғы VialTweeter мата үлгілерінен ақуызды алу үшін (үлкейту үшін басыңыз!)

VialTweeter жанама Ультрадыбыспен.

Артықшылықтары

  • жылдам
  • жоғары өнімділік
  • жоғары тиімді
  • Параметрлерді нақты бақылау
  • ойнатылатын нәтижелер
  • сызықтық масштабтау

Функционалдық iNOS ферменті үшін үлгі дайындау протоколы

Толық функционалды iNOS ферментіне ие болу үшін (мысалы, дәрілік препараттарды тексеру үшін) келесі хаттама ұсынылады: Жасуша суспензиясы мұзға қойылып, UP100H 5 секунд цикл режимінде 10 мкм амплитудасы кезінде. Ультрадыбыспен және 25 сек. мұзда демалу. Процедураны шамамен қайталаңыз. 3 рет. Ультрадыбыспен циклі арасындағы тыныс алу уақыты температура көтерілуін азайтады және денатурация қаупін азайтады.

Ультрадыбыстық ақуызды жою

Ультрадыбыспен ақуызды ертіндету үдерісін жылдамдатуға болады, бұл әдетте бірнеше сағатты қажет етеді. Үлгіні қызып кетпеу және протеиннің бұзылуын болдырмау және несепнәрі бар ерітінділердегі өзгерістерді болдырмау үшін, ультрадыбыстық жарылыс бірнеше секундтан ұзақ уақытқа созылмауы керек.

Жалпы нұсқаулық

Температураны бақылау: Термиялық денатурациясыз жоғары ақуыздың шығуын қамтамасыз ету үшін экстракция кезінде температура бақылануы керек. Hielscher-ның заманауи ультрадыбыстық гомогенизаторлары – ақ ультрадыбыстық дезинтегратор немесе санитаратор деп аталады – дәл бақылауға алынады. Олар температура сенсоры бар. Ультрадыбыстық гомогенизатор параметрлерін орнату кезінде максималды температура орнатуға болады. Бұл температура максималдығына жеткенде, ультрадыбыстық құрылғы үлгісі салқындағанша автоматты түрде тоқтайды.
Буфер: Қолайлы аралықты таңдау және буфердің дұрыс көлемін матадан матаға дейін өзгереді және сынақ және қате сынау арқылы анықталуы керек.
Оқшаулану / тазалау: Ақуыз лизаттарында ДНҚ немесе көмірсулар сияқты биомолекулалардың артық болуы мүмкін, олар белокты жауын-шашынмен (дециксолат-трихлоруксус қышқылы) немесе буферлік алмасу арқылы жойылуы мүмкін.

Chittapalo және Noomhorm (2009) Ультрадыбыспен ақуыздың кірістілігі арта түскенін және ультрадыбыстық мата гомогенизациясы мен лизис процесі бар экстракция процестерін айтарлықтай арттыруға мүмкіндік беретінін хабарлады – жаңа коммерциялық өндіру мүмкіндігін қамтамасыз етуге мүмкіндік береді.

Hielscher дыбыс корпусымен SPB-L және ультрадыбыстық құрылғы UP200St. (Click to enlarge!)

Ультрадыбыстық тіндердің гомогенизаторы UP200St ақуызды тиімді алу үшін

Ультрадыбыстық емдеуді нақты бақылау (үлкейту үшін басыңыз!)

Ультрадыбыспен процестің дәл жұмыс істеуі мен мониторингі үшін шолғышты басқару

Протеинді алу үшін ультрадыбыстық жабдықтар

Hielscher Ультрадыбыспен жасушалардың, тіндердің, бактериялардың, микроорганизмдердің, ашытқылардың және спорлардың ыдырауы үшін ультрадыбыстық гомогенизаторлардың кең ауқымын ұсынады.
Hielscher зертханасының ультрадыбыстық құрылғылары қуатты және оңай жұмыс істейді. Тәулік бойы жұмыс істеуге арналған, олар сенімді және тиімді зертханалық және стендтік құрылғылар ретінде жасалған. Барлық құрылғыларда қуат шығысы мен амплитудасы дәл бақылауы мүмкін. Кең ауқымды керек-жарақтар қосымша орнату параметрлерін ашады. Мұндай сандық құрылғылар сияқты VialTweeter, Uf200 ः T, UP200St, және UP400St автоматтандырылған деректерді жазу үшін кіріктірілген SD картасын және температураны бақылауды біріктіреді.
Жанама, ластаусыз және бір мезгілде бірнеше үлгілерді Ультрадыбыспен үшін біз ұсынамыз VialTweeter немесе Ультрадыбыстық күкірт.
Қолданбаңызға, материалға және үлгі көлеміне қарай, біз сізге үлгі дайындыққа арналған ең қолайлы реттеуді ұсынамыз. Бүгін бізбен байланысыңыз!

Бізбен хабарласыңы! / Алам!

Сіз ультрадыбыстық гомогенизациясы туралы қосымша ақпаратты сұратуға келсе, төмендегі нысанды пайдаланыңыз. Біз сіздің талаптарға сай ультрадыбыстық жүйесін ұсынамыз қуанышты боламыз.









Біздің ескеріңіз құпиялылық саясаты.


Әдебиеттер / әдебиеттер

  • Chittapalo T, Noomhorm A (2009): Ақуызды ұнтақталған крахмалдан және ақуыз концентратының қасиеттерінен алынған ақуыздың ультрадыбыстық көмекті сілтілі шығаруы. Int J Food Sci Technol 44: 1843-1849.
  • Simões, André ES:; Перейра, Диана М.; Амарал, Джоана Д .; Нунес, Ана Ф .; Гомес, София Е .; Родригес, Педро М.; Ло, Адриан С.; Д'Хоге, Руди; Стив, Клиффорд Дж .; Тибода, Стивен Н.; Борральо, Педро М.; Родригес, Сесилия MP (2013): Тризол немесе тризол LS РНҚ экстракциясымен және ұзақ мерзімді сақтаудан кейін бірнеше көздерден алынған ақуыздарды тиімді қалпына келтіру. BMC Genomics 2013, 14: 181.


Біле Worth фактілері

Протеомика

Протеомика - белоктар мен протеомды зерттейтін зерттеу саласы. Ақуыздар организмдерде көптеген тіршілік функцияларын орындайды. Протеома - белгілі бір уақыт ішінде геном, жасуша, тін немесе организм арқылы көрсетілген ақуыздардың бүкіл жиынтығы. Протеомды уақытша және әр түрлі талаптарға немесе стресске байланысты өзгереді, бұл жасуша немесе организм өтеді. Нақтырақ айтқанда, белгілі бір жағдайларда белгілі бір уақытта жасуша немесе организмнің белгілі бір түріндегі көрсетілген протеиндердің жиынтығы. Термин - бұл белоктар мен геномның қосындысы. Протеомика - бұл протеомды зерттеу.

Ақуыз

Протеиндер макромолекулалар деп аталатын үлкен биомолекулалар болып табылады – олар аминқышқыл қалдықтарының бір немесе бірнеше ұзын тізбектерінен тұрады. Ақуыздар өсімдік және жануарлардың барлық организмдерінде кездеседі және олар биологиялық функциялардың көпшілігіне өте маңызды. Протеиндерде көптеген биологиялық ақпараттар болғандықтан, олар аналитикалық мақсаттар үшін шығарылады, мысалы, протеомиялық зерттеулер үшін. Протеиндердің ең маңызды функциясы зат алмасу реакцияларының катализін, ДНҚ-ның репликациясын, ынталандыруға жауапты және молекулалардың бір жерден екінші жерге тасымалдануын қамтиды. Протеиндер бір-бірінен, ең алдымен, олардың гендерінің нуклеотидтік тізбегімен туындаған аминқышқылдарының кезектілігімен ерекшеленеді және әдетте оның қызметін анықтайтын нақты үш өлшемді құрылымға белокты қалыптастырады. Ақуыздар – пептидтен басқа – тағамның негізгі компоненттерінің бірі. Сондықтан протеомиктер тамақ ісі ғылымында үдерістерді оңтайландыру, азық-түлік қауіпсіздігі және тағамдық құндылықтарды бағалау үшін қуатты құрал болып табылады.

Гель электрофорезі

Гель электрофорезі - ДНҚ, РНҚ және белоктар сияқты макромолекулаларды бөлу және талдаудың негізгі әдісі, сондай-ақ олардың мөлшері мен зарядтары негізінде олардың фрагменттері. Клиникалық химияда ақуыздарды зарядтау және / немесе мөлшері (IEF агарозасы, мәні тәуелсіз емес) және биохимия, молекулярлық биология және протеомикадағы ДНҚ мен РНҚ үзінділерінің ұзындығы бойынша аралас популяциясын бөлу үшін ДНҚ мөлшерін бағалау үшін пайдаланылады және РНҚ үзінділері немесе ақуыздарды зарядтау арқылы бөлу.

Жасушалық мәдениеттер

Жасуша культурасы бақыланатын өсіру процесі болып табылады, онда клеткалар бақыланатын жағдайларда өңделеді. Жасуша культурасының шарттары әр ұяшық түріне байланысты болады. Тұтастай алғанда, жасуша мәдениетінің ортасы негізгі қоректік заттар (амин қышқылдары, көмірсулар, витаминдер, минералдар), өсу факторлары, гормондар мен газдар беретін субстрат немесе орта бар тиісті кемеден (Petri ыдысынан) тұрады (CO2, O.2) және физиохимиялық ортаны (рН буфері, осмотикалық қысым, температура) реттейді. Көптеген жасушалар бетіне немесе жасанды субстратқа мұқтаж, ал басқа клеткалық дақылдар мәдени ортада (суспензия мәдениеті, жасуша суспензиясы) еркін жүзу арқылы өсіруге болады.
Жануарлардың жасушалық желілерінің жаппай культуралары вирустық вакциналар мен басқа да биотехнологиялық өнімдерден өнеркәсіптік өндірісте қолданылады. Адамның бағаналы жасушалары клеткалардың санын көбейту үшін және трансплантациялау үшін жасушаларды әртүрлі соматикалық клетка түрлеріне бөледі.

Тіндердің үлгілері

Термині клеткалық аралық қосылысты сипаттайды, онда жасуша материалы жасушалар мен толық орган арасындағы ұйымдастырушылық деңгейде болады. Тіндік түрінде, белгілі бір функцияны орындайтын бірдей туындыдан ұқсас, жасушалар біріктіріледі. Көптеген ұлпалардың функционалдық топтамасы бойынша органдардың күрделі құрылымдары қалыптасады.
Тін биологияда, гистологияда / гистопатологияда, паразитологияда, биохимияда, иммуногистохимияда, сондай-ақ ДНҚ-ны өсіру және алу үшін іріктеледі. Оны жануардан (бөлімше: сүтқоректілер ұлпасы) және өсімдік тінінен ажыратуға болады. Жануарлардың ұлпалары дәнекер, бұлшықет, жүйке және эпителий ұлпаларының төрт негізгі түріне топтастырылған. Өсімдік тіндері келесі үш ұлпалық жүйеге бөлінеді: эпидермис, жердің ұлпасы және тамырлы ұлпа.
Тіндік үлгілер жануарлардан немесе өсімдік бөліктерінен, мысалы, сүйек, бұлшықет, жапырақ және т.б.

Дене сұйықтықтары

Қан, сарысу, плазма, цереброспинальды сұйықтық, сілекей мен синовиальды сұйықтық - бұл диагностикалық маңызды ақпараттың үлкен көзі. Демек, талдау үшін дене сұйықтық үлгілерін күрделі дайындау маңызды. Алғашқы қиындық - дене сұйықтықтарындағы кең динамикалық диапазонмен байланысты.

Ақуыздың концентрациясын анықтау

Брэдфорд талдау, Lowry талдауы және бициншонин қышқылы (BCA) талдауы белоктың концентрациясын анықтау үшін жалпы талдау болып табылады. Ірімшік сарысуы альбумині (BSA) ең жиі қолданылатын белоктардың стандарты болып табылады.

Лизис буфері

Лизис буферін жасуша материалына немесе тініне (мата мәдениетіне, өсімдіктерге, бактерияларға, саңырауқұлақтарға және т.б.) сәйкес таңдалуы керек және жасушалардың құрылымы мен құрылымының түрі бола ма. Ақуыздарды, мембраналарды және органеллаларды алу үшін лизис-буферлердің кең спектрі бір немесе бірнеше жуғыш заттармен тұжырымдалған. Жуғыш зат әдетте сынақ және қателік сынақтары арқылы таңдалады немесе – Егер қолжетімді болса – ақуызды экстракциялау хаттамасына сәйкес. Жуғыш зат мата көзі мен белоктармен үйлесімді болуы керек. Тұтастай алғанда, сығындының барынша функционалдығын қамтамасыз ету үшін нақты мата / протеин үшін жұмыс істейтін ең жұмсақ жуғыш зат таңдалады. Сонымен қатар, мембраналар мен органеллаларды алу кезінде жұмсақ жуғыш зат мембрананы сақтамайды. Лизис буферінде жиі қолданылатын жуғыш заттар көбінесе неоникалық емес немесе цвиттерионикалық, мысалы CHAPS, деоксичолат, Triton X-100, NP40 және Tween 20 болып табылады.
Мысалы, ми, бауыр, ішек, бүйрек, көкбауыр және т.б. сияқты тіндер RIPA – алайда протеаздың ингибиторлары мен DTT (мысалы, гель электрофорезі) қосылуы керек.
20 мкм Трис (pH 7.8), 137 мН NaCl, 2.7 мкм KCl, 1мМ MgCl2, 1% Triton X-100, 10% (салмақ / массасы) глицерин, 1 мкм EDTA үшін лиздік буфер , 1 мк дитиотреитол, протеаз және фосфатаза ингибиторы коктейлімен толықтырылған
Жалпы буферлердің кестесі және олардың рН ауқымы. Әдетте бұл буферлер әдетте 20-50 мМ концентрацияларда қолданылады.

Буфер pH ауқымы
Лимон қышқылы – NaOH 2.2 – 6.5
Натрий цитраты – Лимон қышқылы 3.0 – 6.2
Натрий ацетаты – сірке қышқылы 3.6 – 5.6
Натрий тұзының қышқылдық қышқылы – HCl 5.0 – 7.4
ҚР БҒМ – NaOH 5.6 – 6.8
Натрийдің дигидрогенфосфаты – сутегі фосфаты 5.8 – 8.0
Имидазол – HCl 6.2 – 7.8
MOPS – KOH 6.6 – 7.8
Триэтаноламин гидрохлориді – NaOH 6.8 – 8.8
Трис – HCl 7.0 – 9.0
HEPES – NaOH 7.2 – 8.2
Трикин – NaOH 7.6 – 8.6
Натрий тетрабораты – бор қышқылы 7.6 – 9.2
Бицин – NaOH 7.7 – 8.9
Глицин – NaOH 8.6 – 10.6

Көптеген буферлер температураның рН-тәуелділігін көрсетеді. Бұл әсіресе Триса буферіне қатысты. PKa 8.06-ден 25 ° C-тен 8.85-ке дейін 0 ° C-ге ауысады.
(pH және pKa аралық буферінде: pH ерітіндідегі сутегі иондарының концентрациясын өлшейді pKa (= қышқылдық диссоциацияның тұрақты) - бұл белгілі, бірақ нақты шара, бұл молекуланың қалай жұмыс істейтінін болжауға көмектеседі pH мәні.)

TRIzol

TRIzol - гуанидиний тиоцианат-фенол-хлороформ экстракциясы кезінде РНҚ / ДНҚ / белокты алу үшін қолданылатын химиялық шешім. Ультрадыбыстық көмегімен TRIzol экстракция нәтижелерін жоғары ДНҚ, РНҚ және протеиннің бірдей үлгісінен алуына әкеледі және осылайша басқа экстракция әдістерінен жоғары болады.