Hielscher ультрадыбыстық технологиясы

Э. Колидің ультрадыбыстық лизисі

  • E. coli бактериялар микробиология мен биотехнологиядағы ең жиі қолданылатын бактериялар болып табылады.
  • Ультрадыбыстық жасуша бұзушылары E. coli лизисіне сенімді және қайталанатын нәтижелер береді.
  • Интенсивті, бірақ нақты басқарылатын кавитация және жылжыту күштері толық бұзылуға және жоғары экстракцияның шығуына әкеледі (мысалы, белоктар, ДНҚ).

Кавитация арқылы жасуша бұзылуы

Escherichia coli бактериялары ультрадыбыстық тіндердің гомогенизаторы арқылы сенімді лизирленген.Ультрадыбысты зонд үлгілері гомогенизаторлары шамамен жұмыс істейді. Секундына 20 000 цикл (20кГц кезінде) және сұйықтықтардағы немесе күкірттегі кавитацияны тудырады. Вакуум тәрізді қысымдар мен жоғары температуралардың акустикалық кавитациясының микроскопиялық аумақтары жасушаларды бөліп тастайды. Температураның бірнеше мың градус Цельсийге жетуі мүмкін болса да, кавитацияның көлемі тым аз, бұл процесті айтарлықтай қыздырмайды. Ультрадыбыстық акустикалық кавитация және ығысу күштері E.coli клеткалық мембранасын перфорациялады немесе бұзады – ультрадыбыстық гомогенизатордың құрылғының параметріне байланысты.

Ультрадыбыстық Лизистің артықшылықтары

  • лизистің дәлдігін бақылау (қарқындылық, амплитуда, температура)
  • нақты үлгілерге оңтайлы бейімделу
  • температураны бақылау
  • өте үлкен және өте үлкен үлгілер үшін (мкл дейін литр)
  • таза механикалық өңдеу
  • лабораториядан өндіріске дейін сызықтық кеңею
Ультрадыбыстық құрылғы VialTweeter сол процестің шарттарында 10 флаконға дейін синтетикалық үлгіні дайындауға мүмкіндік береді. (Click to enlarge!)

VialTweeter ультрадыбыстық лизис үшін

Ақпараттық сұрау




Біздің ескеріңіз құпиялылық саясаты.


Химиялық және энзимтикалық лизис проблемалық болуы мүмкін – өйткені химиялық лизис протеин құрылымдарын өзгерте алады және тазарту мәселелерін енгізе алады және ферментативті лизис ұзақ инкубациялау уақыттарын талап етеді және қайта шығарылмайды – ультрадыбыстық бұзылу күрделі, тез жасушалық бұзылу әдісі болып табылады.
Ультрадыбыстық лизис тек механикалық күштерге негізделген. Химиялық заттар қосылмайды, ультрадыбыспен ығысу күші жасуша қабырғасын бұзады. Химиялық лизис ақуыздың құрылымын өзгерте алады және тазарту мәселелерін туындатады. Ферментативті бұзу ұзақ инкубациялық уақытты қажет етеді және қайталанбайды. E.coli бактерияларының жасушаларының ультрадыбыстық бұзылуы тез, қарапайым, сенімді және жаңғыртылады. Сондықтан Hielscher ультрадыбыстық құралдары бүкіл әлемдегі биологиялық және биохимиялық зертханаларда сынама дайындау, ананлитикаға дейінгі, in-vitro диагонстика және коллекторлық талдау үшін қолданылады.

Жалпы ұсынымдар

Ағымдық реактормен UP400St ultrasonicatorУльтрадыбыспен жасушалық суспензияның өте кішкентай, орташа және үлкен мөлшерін лизингке арналған ең танымал әдіс – Пико-литрден 100 л / сағ дейін (ультрадыбыстық ағын ұяшығын пайдалану арқылы). Ұяшықтар сұйықтық және кавитация арқылы лизирленген. ДНК-ақ Ультрадыбыспен кезінде ығысып жатыр, сондықтан DNase-ты жасушаның суспензиясына қосудың қажеті жоқ.
Температураны бақылау:
Үлгіні алдын-ала салқындату және мұздағы Ультрадыбыспен үлгіні сақтау кезінде сынаманың термодинамикалық үлгілеуін оңай алдын алуға болады.
Ең дұрысы, үлгілерді лизис кезінде мұздату керек, бірақ көптеген үлгілер үшін температура мәдениет немесе мата көзінің температурасынан жоғары болмаса жеткілікті. Сондықтан, суспензияны мұзға ұстап, бірнеше қысқа ультрадыбыстық импульстармен 5-10 секунд ұлсауға және 10-30 секундқа тоқтатуға ұсынамыз. Үзіліс кезінде температура төмен температураны қалпына келтіру үшін жылу мүмкін. Үлкен жасушалық үлгілер үшін, салқындатқыш курткалармен әртүрлі ағындық жасушалық реакторлар бар.

E. Coli Lysates дайындау хаттамалары

Комбинат анализі және рекомбинантты ақуызды тазарту

E. coli пелеті ультрадыбыстық жүйемен уландырылды UP100H (Hielscher). Осы мақсатта жасуша пеллесі салқындатылған лизис буферінде (50 мм ТриС-HCl pH = 7,5, 100 ммМ NaCl, 5мМ DTT, 1мМ PMSF) қайта жанданды және 10 мин ішінде мұзда салынады. Содан кейін жасуша суспензиясы 10 секунд ішінде 10 рет қысылып, содан кейін салқындату үшін 30 секундта ұлғаяды. Ақыр соңында, ультрадыбыстық қалдықтар 14000 айн / мин кезінде 4 мин. RPR растауын растау үшін, үстіңгі қабат 12% полиакриламид гелінде іске қосылды және SDS-PAGE және батыс блоктарымен талданды. RPR тазалау Ni көмегімен жасалды2+-NTA шайыры (Invitrogen, АҚШ) өндірушінің нұсқаулығы бойынша. Осы кезеңде табиғи тазарту әдісі қолданылды. Тазартылған ақуыздың тазалығы 12% полиакриламид гелінде электрофорез және кейіннен Coomassie көк түсті бояу арқылы бағаланды. Тазартылған ақуыз концентрациясы Микро BCA ақуызды талдау жиынтығымен өлшенді (PIERCE, АҚШ). (Azarnezhad және т.б., 2016)

Лизис, ультрадыбыстық жасуша UP100H (100W) лизис, жасуша бұзылысы және ДНК кесу.

Ультрадыбыстық гомогенизатор UP100H (100W)

Жасуша өсуі, қиылысуы және E. coli Cell Extracts дайындау

SeqA және RNA полимеразы үшін ChIP-Chip E. coli MG1655 немесе MG1655 ΔσqA 37 ° C-де OD600 50 мл LB (+ 0,2% глюкоза) 0,15-тен шамамен миллилитрге 27 мкл формальдегид (37%) қосылды (соңғы концентрация 1%). Қоспалы байланыс баяу шайқау кезінде (100 айн / мин) бөлме температурасында 20 мин ішінде орындалды, содан кейін 10 мл 2,5 М гликинмен (соңғы концентрациясы 0,5 М) сөндірілді. Ыстық соққыға арналған эксперименттер үшін E. coli MG1655 65 мл LB ортасында 30 ° C-де OD600 0.3 шамасында. Содан кейін 30 мл мәдениет алдын ала жылыған ыдысқа 43 ° C температураға ауыстырылды, қалған бөлігі 30 ° C температурада сақталды. Қоспаға қосу және сөндіру, жоғарыда сипатталғандай, бөлме температурасында баяу шайқалмас бұрын, жасушалар 5 мин ішінде 30 немесе 43 ° C температурада сақталған. Ұяшықтар центрифугалау арқылы жиналып, екі рет суық TBS (7.5 рН) арқылы жуылады. 1 мл лизис буферінде (10 мл ТРС (рН 8,0), 20% сахароза, 50 мкм NaCl, 10 мг EDTA, 10 мг / мл лизозима) және инкубация кезінде 37 мин ішінде 30 мин ішінде 4 мл IP буферде ұяшықтарда 12 рет 30 секундтық мұзда және 30 секундтық үзілісте Ультрадыбыспен жүргізілді UP400St 100% қуаты бар ультрадыбыстық процессор (Hielscher Ultrasonics GmbH). 9000 г кезінде 10 минутта центрифугалаудан кейін -20 ° C-де супернатанттың 800 мкл аликотасы сақталды. (Waldminghaus 2010)

Ферменттердің артық өндірілуі және тазалануы.

Декахистидиннің (His10) -қалыпты протеиндерін өндіру үшін E. coli BL21 (DE3) PET19b конструкцияларымен өзгертілді. Түнгі препараттар центрифугалау арқылы жиналды, ал 1% -ы экспрессия мәдениетін егу үшін пайдаланылды. ПЭТ 19мгБ тасымалдайтын ұяшықтар оптикалық тығыздығы 600 нм-ге дейін 22 ° C-де өсірілген600) 0,7. Мәдениет 17 ° C-қа ауыстырылды және 100 мкм IPTG арқылы индуцирленген. 16 сағаттан кейін мәдениет 4 ° C температурасында 7,500 × градусқа центрифугалау арқылы жиналды. Жасушалар 50 мМ фосфат-буферлік тұзды (PBS) 0,7 М NaCl-мен рН 7,4-де қайта жандандырылып, S2 микро-ұшты sonotrode арқылы ultrasonication арқылы бұзылған UP200St ultrasonicator (Hielscher, Teltow, Германия) 0,5 циклінде және амплитудасы 75%.
Декахистидин-тегтелген GtfC-нен артық өндіру 37 ° C температурада ОД-ға енгізілді600 100 мкм IPTG бар 0,6. Содан кейін ұяшық 4 сағ ішінде инкубацияланды, жиналған және жоғарыда көрсетілгендей MgbB үшін лизирленген.
Шикі жасуша сығындылары 15000 × г және 4 ° C температурада центрифугаланған болатын. Тазартылған сығындылары ÄKTAprime Plus жүйесі (GE Healthcare) арқылы 1 мл HisTrap FF шикі бағандарына жүктелді. Ферменттер His-тегелген белоктардың градиентсіз элюі үшін өндірушінің хаттамасына сәйкес тазартылды. Элюталған протеиндер ерітінділері 50 мкм PBS, рН 7,4, 1000 мкм болатын, 4 ° C кезінде 0,3 М NaCl-ге теңестірілді. Тазарту 12% SDS-PAGE арқылы талданды. Ақуыздың концентрациясы Роти-Свит (Carl Roth GmbH, Карлсруэ, Германия) көмегімен Брэдфорд әдісімен анықталды. (Rabausch және т.б., 2013)

E. coli бактерияларынан алынған протеинді алу
Қызығушылығы белок (бұл жағдайда Arabidopsis thaliana MTV1) GST тегіне қосылып, BL21 Escherichia coli (E. coli) жасушаларында көрсетілген.
1. GST-MTV1 және GST (біркелкі 50 мл бактериялық мәдениетке) бір түйірін алып, 2,5 мл мұзды салқындату буферінде әрқайсысына қайта қосыңыз.
2. ultrasonicator пайдаланыңыз UP100H (шағын көлемде (2-5мл) MS3 микротипоматотродымен жабдықталған) бактериялық жасушаларды олар лизис болғанша бұзады, бұл ашықтықтың төмендеуі мен тұтқырлықтың жоғарылауымен көрінеді. Бұл мұзда жүзеге асырылуы керек және оны ұлғаяды (мысалы, 10 секунд, содан соң мұзда 10 секунд). Тым жоғары қарқындылығымен Ультрадыбыспен емес, қамқорлық керек. Егер көбік пайда болса немесе ақ тұнбаның пайда болуы анықталса, қарқындылық төмендетілуі керек.
3. Лизистен жасалған бактерия ерітіндісін 1,5 мл микробактерлі түтікшелерге және центрифугаға 4 ° C, 16,000 хг 20 минутқа тасымалдаңыз.

E. coli-дегі альликин-модификацияланған протеиндер

VialTweeter шағын үлгі гомогенизациясы үшін ыңғайлы ультрадыбыстық құралСульфгидрилді мазмұны 5,5'-Дитиобис (2-нитробензой қышқылы) (ДТНБ) талдауын анықтау
MOPS минималды ортасын (1: 100) егу үшін E. coli MG1655 түнгі мәдениеті пайдаланылды. Мәдениет А400-ден 0,4 дейін жеткенге дейін аэробтық өсірілді. Стресс-емдеу үшін мәдениет үш 15 мл-ға бөлінген. Тазаланбаған мәдениет теріс бақылау ретінде қызмет етті. 0,79 мл аллицин (128 мкл мл-1) немесе әрбір 1 мД диамид қалған екі мәдениеттің біріне қосылды. Мәдениеттер 15 минут бойы инкубацияланды. Әр мәдениеттің 5 мл центрифугалаумен (8,525 × г, 4 ° C, 10 мин) жиналды. Ұяшықтар екі рет жуылады 1 мл PBS (137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 2 мкм КХ2PO4, пайдаланудан бұрын анаэробты түрде сақталатын pH 7,4) және центрифугаланған (13,000 × г, 4 ° C, 10 мин). Жасушалар ультрадыбыстықпен 4 ° C температурада бұзылыстардың алдында лизис буферінде (6 мМ гуанидийн HCl, рН 7,4)VialTweeter ultlasonicator, Hielscher GmbH, Германия) (3 × 1 мин). Целлюлоза центрифугалаумен (13,000 × г, 4 ° С, 15 мин) целлофанның қоқыстары болды. Супернатант магнитті араластырғышпен бірге 3,5 мл-ден QS макроварной кюветқа (10 мм) ауыстырылды және 1 мл лизис буферімен араластырылды. Үлгілердің бөлінуі 412 нм кезінде бөлме температурасында PSC-718 температуралық басқарылатын ұяшық ұстағышымен (Jasco) жабдықталған Jasco V-650 спектрофотометрімен бақыланды. 3 мл дитиобис (2-нитробензой қышқылы) ерітіндісінің 100 мкл қосылды. Шығару қанықтылыққа жеткенше бақыланды. Тиол концентрациясын есептеу экстракция коэффициенті ε көмегімен орындалды412 = 13 700 М-1 см-1 Тио-2-нитробензой қышқылы (TNB) үшін. Cellular thiol концентрациясы E. coli жасушаларының көлемі 6,7 × 10 көлемінде есептелді-15 литрі және A ұяшығының тығыздығы600 = 0,5 (1 × 10 тең)8 клеткалар мл-1 мәдениет). (Müller және т.б., 2016)

Виво глутатион анықтау

E.coli MG1655 MOPS минималды ортада жалпы көлемде 200 мл көлемінде А-ға дейін өсірілді600 0,5-ке жетті. Стресс-емдеу үшін мәдениет 50 мл-ға бөлінген. 0.79 мг аллицин, 1 мм диамид немесе диметил сульфоксиді (бақылау) бар инкубация 15 минуттан кейін 4000 г 4 ° C кезінде 10 мин ішінде жиналды. Ұяшықтар KPE буферімен екі рет 700 мкл KPe буферінде түйіршіктерді қалпына келтіруге дейін жуылады. Депротирования үшін ультрадыбыспен жасушалардың бұзылуына дейін (3 х 1 мин; VialTweeter ultrasonicator). Сұйықтықтар центрифугалаудан кейін жиналды (30 мин, 13000 г, 4 ° C). Сульфосалицил қышқылының концентрациясы КОЭ буферінің 3 томын қосу арқылы 1% -ға дейін төмендеді. Жалпы глутатион және GSSG өлшемдері жоғарыда сипатталғандай орындалды. Жасуша глутатионының концентрациясы E. coli жасушаларының көлемі бойынша 6.7×10-15 литрі және A ұяшығының тығыздығы600 0.5 (1-ге тең)×108 клеткалар мл-1 мәдениет). GSH концентрациясы жалпы глутатионнан 2 [GSSG] түсіру арқылы есептелген. (Müller және т.б., 2016)

Жасуша лизисі және биологиялық материалдарды алу үшін ультрадыбыстық бұзылыс (үлкейту үшін басыңыз!)

Прибор типті ultrasonicator UP400St

E. coli адамның mAspAT білдіруі

Жасушааралық затты (мысалы, белоктар, органеллалар, ДНҚ, РНҚ және т.б.) алу үшін Ультрадыбыстық жасуша бұзушысы UP400St (400 Вт)100 мг / мл ампициллин бар 30 мкл Luria-Bertani (LB) ортасында экспрессиялық векторды ұстайтын E. coli BL21 (DE3) бір колониясы, содан кейін оптикалық тығыздыққа дейін (OD600) 0,6-ға жетті. Жасушалар центрифугалау арқылы 10 мин ішінде 4000хг мөлшерінде жиналды және 100 мл / мл ампициллині бар 3L fresh LB ортада қайта жанданды.
Содан кейін ақуыздың экспрессиясы 1 мМ изопропил β-ᴅ-1-тиогалактопиранозидпен (IPTG) 20 сағат ішінде 16 ° C температурасында индуцирленген болатын. Жасушалар центрифугалау арқылы 15 минутта 8000 г-да жиналды және буфер A (20 мМ NaH2PO4, 0,5 M NaCl, pH 7,4 )мен жуылады. Жақсартылған 45 г (ылғалды салмақ) жасушалар 3 л мәдениетінен алынған. Центрифугалаудан кейін жасуша таблеткалары 40 мл (1 литрлік мәдениет үшін) мұзды салқындату буферлі A-де қайта жанданды және ультрадыбыстық арқылы мұзды суық температурада лизирленген UP400St құрал (Dr. Hielscher GmbH, Германия). Жасуша лизисі еритін (суператантты) және тұнбаланған (түйіршікті) фракцияларды бөліп алу үшін 15 мин ішінде 12,000 айн / мин кезінде центрифугаланған. (Цзян және т.б., 2015)

Төменде келтірілген кестеде біздің ультрадыбыстық құрылғыларымыздың шамамен өңдеу қуаттылығы көрсетіледі:

илеудің көлемі Ағынның жылдамдығы Ұсынылған құрылғылар
01,5-тен 1,5 млн na VialTweeter
1-ден 500 млн 10 - 200мл / мин UP100H
10-дан 2000мл 20-дан 400мл / мин Uf200 ः T, UP400St
0.1 - 20L 0.2 - 4L / мин UIP2000hdT
10-нан 100 литрге дейін 2-ден 10 л / мин UIP4000
na 10-нан 100 л / мин дейін UIP16000
na үлкенірек кластерлік UIP16000

Бізбен хабарласыңы! / Алам!

Сіз ультрадыбыстық гомогенизациясы туралы қосымша ақпаратты сұратуға келсе, төмендегі нысанды пайдаланыңыз. Біз сіздің талаптарға сай ультрадыбыстық жүйесін ұсынамыз қуанышты боламыз.









Біздің ескеріңіз құпиялылық саясаты.


Әдебиеттер / әдебиеттер



Біле Worth фактілері

E.coli

Escherichia coli (E. coli) - грам-теріс, ферментативті түрде анаэробты, шоқ тәрізді, колхозды бактерия, Escherichia тектес, ол жылу қан ағзаларының төменгі ішектерінде (эндотерм) кездеседі. Түрлі сипаттамалары бар E. coli штамдары (немесе подтиптер) көп. E. coli штамдарының көпшілігі адамдарға зиян келтірмейді, мысалы, зертханаларда зерттеулерді қолдану үшін әдетте пайдаланылатын B және K-12 штамдары. Дегенмен, кейбір штаммдар зиянды және ауыр сырқаттанушылық тудыруы мүмкін.
E. coli қазіргі заманғы биологиялық инжинирингте және өнеркәсіптік микробиологияда маңызды рөл атқарады, өйткені бактериялар оңай басқарылады. E. coli жиі пайдаланылатын, мысалы, рекомбинантты дезоксирибонуклеин қышқылын (ДНҚ) жасау немесе модельдік ағзаға айналу сияқты жалпы зертханалық қолдану.
E. coli - гетерологиялық ақуыздарды өндіруге арналған өте әмбебап хост, және E. coli-дегі рекомбинантты ақуыздарды алу үшін көптеген алуан ақуызды білдіру жүйелері қол жетімді. Ақуыздың жоғары деңгейде көрінуіне мүмкіндік беретін плазмидтерді пайдалану бактерияларға енгізілуі мүмкін, бұл осындай протеиндерді өнеркәсіптік ферменттеу процестерінде жоғары мөлшерде өндіруге мүмкіндік береді.
E.coli инсулин шығару үшін жасушалық фабрикалар ретінде қолданылады. Кейінгі бағдарламаларда вакциналарды және иммобилизденген ферменттерді әзірлеу, өндіру және өндіру, биоотын өндіру үшін, сондай-ақ биоремедиация үшін модификацияланған E. coli жасушаларын пайдалану кіреді.
К-12 штаммы E. coli мутантты нысаны болып табылады, ол алкилин фосфатазының (ALP) ферменті туралы көбірек біледі. Бұл мутация ферментті үнемі кодтайтын гендегі ақаулыққа байланысты болады. Егер ген ешқандай тыйым салмайтын өнімді шығарса, бұл құрылтай іс-әрекеті деп аталады. Бұл ерекше мутантты пішін ALP ферментін оқшаулау және тазарту үшін қолданылады.

Ультрадыбыстық ДНК Ығысу

Ультрадыбыстық ысырап күштері жасушадан бөлініп, ДНҚ талшықтарын бөліктерге бөлуге арналған әдеттегі әдіс. Акустикалық кавитация ұяшықтардың қабырғалары мен мембраналарын бұзады және ДНК-ны жасушадан шығарады және шамамен 600 – Талдау үшін өте ыңғайлы 800 б.п.
ДНҚ үзіндісі үшін ультрадыбыстық гомогенизаторлар туралы көбірек білу үшін осында басыңыз!