Hielscher ультрадыбыстық технологиясы

Ультрадыбыстық ДНК Ығысу

  • ДНҚ мен РНК кесу кезінде ДНҚ молекулалары кішірек бөліктерге бөлінеді. ДНҚ / РНҚ үзіндісі - келесі ұрпақ схемаларына (NGS) арналған кітапханаларды құруды қажет ететін маңызды қадамдардың қадамдық қадамдарының бірі.
  • Ультрадыбыстық ДНК кесу кезінде ДНҚ-ны немесе РНҚ-ны 100-ден астам бөліктерге бөлуге арналған акустикалық кавитация күштері қолданылады. – 5kb bp.
  • Ультрадыбыстық кесу дәл ДНҚ үзіндісі мен қалаған ДНҚ ұзындығына бейімделуге мүмкіндік береді.

 

Ультрадыбыстық ДНК Ығысу

Hielscher Ultrasonics компаниясы ДНК, РНҚ және хроматинді кесу үшін әр түрлі ультрадыбыстық негіздегі шешімдерді ұсынады. Микротиппен тікелей түрлендіруге арналған зонд үлгілері ультрадыбыстық құрылғылармен (мысалы, UP100H) немесе бір мезгілде түрлі үлгілерді жанама ДНҚ дайындау үшін VialTweeeter немесе ультрадыбыстық күкіртті қолданыңыз. Hielscher сіздердің қажеттіліктеріңізді ескере отырып, керемет құрылғы ұсынады: 1 немесе 10 үлгіге дейін, микролитерден литрлік көлемге дейін – Hielscher ультрадыбыстық процессорлар ДНК, РНҚ және хроматин фрагменттерін дұрыс ұзындығы бойынша дайындау үшін сіздің талаптарыңызға сай келеді. Өрбу қабілеттілігі, қарапайымдылығы және нақты басқару мүмкіндігі келесі ұрпақ реті бойынша сенімді кітапханаға мүмкіндік береді.
Ферментативті ДНҚ-ның фрагментациясынан айырмашылығы, ультрадыбыстық кесу ешқандай химиялық заттарды қоспай, таза механикалық ығысу күштерін қолданады. Процессордың параметрлерін дәл анықтау арқылы ультрадыбыстық кесу жоғары молекулалы салмақ ДНҚ үзінділерін (плазмид пен геномдық ДНҚ) шығарады.
Тазартылған нуклеин қышқылдарын бөлшектеу қадамына дейін немесе кейін күшейтуге болады.
Sonication параметрлері (қуат, импульстік цикл / жарылыс, уақыт пен температура) бағдарламалық жасақтама параметрлері арқылы қауіпсіз басқарылуы мүмкін.

Артықшылықтары:

  • дәл бақылау
  • Ультрадыбыспен айналдыру циклі мен қажетті ДНҚ мөлшеріне дәл бейімделетін уақыт
  • жоғары молекулярлық салмақ ДНҚ үзінділері
  • температураны бақылау
  • Жылдам
  • ойнатылатын нәтижелер
  • автоклавты
  • түрлі шешімдер: Прибор типі, VialTweeter және CupHorn

Ультрадыбыстық ДНҚ-ды кесу үшін хаттамалар

Хроматиннің иммуноприпитациясын талдау үшін

Қысқа айтқанда, жасушалар 60 мм-диаметрлі ыдыста (400 000 бір ыдыс) жабылып, RhoA siRNA-мен (суреттелгендей) ауыстырылды; 72 сағаттан кейін олар формальдегидпен (соңғы концентрациясы, 1%) 37 ° C температурада 10 минут ішінде ДНК-ға кросс-байланыстыратын белоктарға инкубацияланған. Тоғыспалы байланыс реакциясы он-лік көлемі 1,25 моль / л глицинді қосу арқылы тоқтатылып, 125 ммоль / л соңғы концентрациясын берді. Ұяшықтар екі рет мұзбен суытатын PBS-мен жуып, радиоиммунопреципитация талдау буферінде [150 ммоль / л NaCl, 1% NP40, 0,5% деоксичолат, 0,1% SDS, 5 ммоль / л EDTA, 50 ммоль / л Tris-HCl (рН 8,0 )] 1 ммоль / л фенилметилсульфонилфторды, 1 а / м л aprotinin және 1 Аг / мл пепстатин А бар және 30 мин ішінде мұзда сақталады. Содан кейін, ұяшық лизаттары мұзбен зарядталған Hielscher UP200S ультрадыбыстық изоляторлар (3 х 40 с, амплитудасы 40%, цикл 1, Hielscher Ultrasonics GmbH), кросс-байланыстырылған хроматиндер 200 және 1000 б.п. Бүкіл лизаттың оннан бір бөлігі әртүрлі үлгілерде бар ДНҚ мөлшерін сандық бағалау үшін пайдаланылды және ол саналады “жалпы енгізу ДНҚ”. Супермонтаттар лососец дозасы ДНК / ақуыз агарозымен - 50% суспензияға арнайы емес фонды азайту үшін инкубацияланған. Иммунопреципитация кейіннен 4 ° C температурасында 5 Аг анти-NF-nB p65 (Upstate) немесе антиденелерсіз (теріс бақылау) кезінде жасалды. Бұл суперматаншылар 5 мол / л NaCl-мен толықтырылып, протеин-ДНҚ кросс-сілтемелерін қайтару үшін түнде 65 ° C температурада қызады. Иммундық комплекстер одан әрі DNase- және RNase-free протеиназ K-мен емделді, ал ДНҚ фенол / хлороформ экстракциясы мен этанолдың жауын-шашынымен тазартылды. ПТР адам iNOS генінің промоторы аймағындағы тізбеге сәйкес келетін нақты праймерлермен жасалды (p1 primer: 5¶-GAGGGCTTTCCCA- GAACCAAG-3; p2 primer: GCTGGGCTACTGACCCAG- CAGTTCCAG-3). (Doublet және басқалар, 2008)

EGFP-өрнектерін зерттеу

Экспрессивті зерттеулер үшін EGFP (кеңейтілген жасыл флуоресцентті протеин), интеграцияланған хромосомалық ssu интегралды геніне арналған рекомбинантты штамм L. tarentolae p10 :: F9Begfp1.4dBsat # 12 (Jena Bioscience, Германия) түрлі бұқаралық ақпарат құралдарында бұрын сипатталған және қосымша 100 мг-нан толықтырылды-1 Nourseothricin (Йена Bioscience, Германия). Культивация кезінде 1 мл үлгілері алынған, центрифугаланған (2000 × г, 20 ° C, 10 мин) және 0,9% NaCl ерітіндісімен жуылады. Пеллет буферде қайта қалпына келтірілген (20 мкм HEPES, 5мм EDTA, 2мМ DTT) және ультрадыбыстық процессормен уландырумен бұзылған UP400S (энергиясын ~ 400 Вт). Целлюлоза қалдықтары Центрифугалау (6000 × г, 4 ° С, 5 мин) арқылы жойылып, Laemmli (1970) әдісіне сәйкес қалпына келтірілген шарттарда натрий додецил сульфаты - полиакриламидті гель электрофорезі (SDS-PAGE) арқылы талданады, 12,5% полиакраламидті гель . EGFP-өрнегі қызған мәдениетте зерттелді. (Fritsche және т.б., 2007)

Hielscher's UP100H микросхема талдауы үшін EHEC ДНҚ дайындау үшін пайдаланылды

E. coli EDL933 геномдық ДНҚ-ның электрофоретикалық талдауы 0 - 15 мин ультрадыбыстық әсерге ұшырады. L DNA сатысы көрсетіледі. (Basselet және т.б., 2008)

Ақпараттық сұрау




Біздің ескеріңіз құпиялылық саясаты.


Хроматиннің иммунопреципитациясы

Лизис, ультрадыбыстық жасуша UP100H (100W) лизис, жасуша бұзылысы және ДНК кесу.Хроматиннің иммунопреципитациясы талдауы ChIP-IT көмегімен жасалдыTM Экспресс (Active Motif, Carlsbad, CA, АҚШ) өндірушінің нұсқауларына сәйкес, кейбір модификациялары бар. Қысқаша айтқанда, дифференциалды адам позитивтері бөлме температурасында 10 мин ішінде 1% формальдегидпен байланысқан. Ұяшықтар мұзды мұзды PBS-мен жуылады және түзету реакциясы бөлме температурасында 5 мин ішінде 0,125 М глицин қосып тоқтатылған. Ұяшықтар қайта мұздаған PBS-мен жуып, ыдысынан қырылып кетті. Жасушалар центрифугалау арқылы жиналды және лизис буферінде қайта жанданды. Центрифугалаудан кейін пеллеттелген ядролар жылжымалы буферде қалпына келтірілді, мұзда 30 минут ішінде инкубацияланды, ал хроматин Ультрадыбыспен кесіліп, мысалы, UP100H (Hielscher Ultrasonics GmbH, Teltow, Германия) 25% қуатпен 5 рет 20 секунд сайын шамамен 200-600 б.т. Содан кейін ығысқан хроматин центрифугаланып, супернатант жиналды. Иммунопрепараттар үшін 60 мкл хроматин 1 мкг Sp1 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, АҚШ), NF-κB p65 (Abcam, Кембридж, Ұлыбритания) немесе NF-κB p50 (Abcam) антиденелерімен немесе қоянмен инкубацияланды IgG (Зимед зертханалары, Оңтүстік Сан-Франциско, СА, АҚШ) теріс бақылау ретінде, түнде 4 ° C температурада жұмсақ айналу арқылы. Магниттік бусиндерге байланған иммундық комплекстер магниттік стенд арқылы жиналды, кеңінен жуылады және ақуыз / ДНҚ-ның кері байланысы кері қайтарылады және ДНҚ нақты уақыттық ПТР талдау үшін алынады. (Ristola және т.б., 2009)

Чиптің жиынын талдау үшін EHEC ДНК дайындау

Жасуша лизаттарын және алынған ДНҚ-ны ұйымдастыру
ПБС-да уақытша шоғырлануға қажетті бактериялық түйіршіктер өңделді Ультрадыбысты бұзу UP100H (Hielscher GmbH, Германия) MS1 (диаметрі 1 мм) микротипспен жабдықталған. Жұмыс жиілігі 30 кГц және тиімді шығу қуаты 100 Вт болды. Операция кезінде үлгілер мұзды су ваннасында салқындатылып, аралас және центрифугаланған. Сынамалар ағын цитометриясын зерттеу үшін пайдаланылды, ал кейінгі өңдеу үшін үлгілер жылу өңдеуге (95 ° C, 5 мин) ұшырады. Шикі жасуша лизаты фенол қоспасы арқылы өңделді: хлороформ: изоамил спирті (25: 24: 1). Бұл қоспаның тең көлемі лизаттың үлгісіне қосылып, ерітінді 15 с үшін күшті құйылып, бөлме температурасында (RT) 22 минуттан кейін 15000 хг-да центрифугаланған. Геномдық ДНҚ бар жоғарғы су фазасы мұқият бөлініп, жаңа стерильді Eppendorf түтігінде жиналды.
Кейіннен үлгілер ДНҚ-ны бөлшектеу үшін Ультрадыбыспен жүргізілді. Ультрадыбыспен қадам жоғарыда сипатталғандай жағдайларда жүзеге асырылды. Геномдық ДНҚ-ның бөлшектеу әсерін бағалау үшін үлгілер агарозды гель электрофорезі арқылы талданды.
(…) Бұған дейін 2,5 минут бойы уландырылған үлгілер термиялық өңдеуден кейін және центрифугалаудан кейін экстракция қадамына ұшырады. Босатылған ДНҚ екі рет фенол: хлороформ: изоэмил спирті қоспасы арқылы экстрагирленді және одан кейін екінші 0-ден 15 минуттық Ультрадыбыспен өткізілді. Газдың электрофорезі кейіннен экстракция ультрадыбыстық фрагментацияға ұшыраған ДНҚ мөлшерін анықтау үшін пайдаланылды (жоғарғы оң жақта). Жоғары бөлінген ДНҚ молекулалы салмақ белдеулерінен гөрі ДНК-нің пайда болуынан айқын болды, олар 2,5 мин немесе одан ұзындықта уландырылған үлгілерден жойылды. Ұзақ Ультрадыбыспен біртіндеп фрагменттің ұзындығын шамамен 150-600 б.п-ге дейін азайтты, ал 15 минуттық Ультрадыбыспен осы фрагменттерді одан да төмендетеді, бұл негізінен, смарттың жоғарғы жағында көрінеді. Осылайша, орташа ДНҚ фрагменті мөлшері ultrasonication уақытымен бірте-бірте төмендеді және 5 мин емдеу чипті массивтік талдау үшін ең қолайлы ДНҚ бөліктерінің мөлшерін алуға мүмкіндік берді. Ақырында, алғашқы 2 мин ультрадыбыстық өңдеуден, ДНҚ экстракциясынан (2 ×) және одан кейінгі 5 мин. Ультрадыбыспен қамтылған ДНҚ талдауға дайындық процедурасы белгіленді. (Basselet және т.б., 2008)

Хроматиннің иммунопреципитациясы (CHIP)

Ultrasonic processor UP100H for DNA, RNA and chromatin shearing. (Click to enlarge!)HEK293 жасушалары жоғарыда сипатталғандай өсіріліп, бөлме температурасында 45 мин бойы 2 мМ дисукцинимидил-глютаратпен бекітілген. Кейіннен жасушалар PBS-мен екі рет жуылады. Хроматин 1% (в / в) формальдегид арқылы бөлме температурасында 10 минут бойы өзара байланысқан және мұзды PBS-мен екі рет жуылады. Қосылу реакциясы бөлме температурасында 5 мин ішінде 0.125 М соңғы концентрациясында глицинмен инкубациялау арқылы тоқтатылды. Трипсинмен инкубациядан кейін жасушалар жасуша мәдениетінің ыдысынан қырылып, PBS-мен екі рет жуылады. Жасуша таблеткасы лизис буферінде (5 мМ құбырлар, pH 8,0, 85 мкм KCl және 0,5% (в / в) Nonidet P-40) қайта жанданды, мұзда 10 минут бойы инкубацияланды және Dounce гомогенизаторымен гомогенизацияланды. Одан кейін ядролар центрифугалаумен (3500хг, 5 мин, 4С) центрифугацияланып, ядро ​​буферінде (50 мН Трис-HCl, рН 8,1, 10 мМ ЭДТА және 1% (а / а) SDS) қайта жанданды. Ядролары Ультрадыбыспен бұзылған болатын, оның ішінде 20-ға жуық импульс UP50H sonicator (Hielscher Ultraschall Technologie) циклі 0,5 және амплитудасы 30% болғанда, массасы 200 - 1000 б.п. болатын геномдық ДНҚ үзінділерін береді. CIP үшін 50 г ДНҚ иммуноприпитация буферінде (16.7 мM Tris-HCl, pH 8.1, 167 мкм NaCl, 1.2 мM EDTA, 1.1% (көлем / көлем) Triton X-100 және 0.01% (w / v) SDS). (Weiske және т.б., 2006)

Хроматиннің иммунопреципитациясымен (ChIP)

Қысқаша, 6 x 106 жасушалар PBS-мен екі рет жуылады және 0,5% формальдегид қатысуымен бөлме температурасында 15 минут бойы мәдениет тақтайшасына қиылысады. Cross-linking реакциясы 0,125 М глицин қосып тоқтатылды. Барлық келесі қадамдар 48 ° C температурада жүргізілді. Барлық буферлер алдын-ала салқындатылған және протеаз ингибиторлары бар (Complete Mini, Roche). Ұяшықтар PBS-мен екі рет жуып, содан кейін қырынды. Жиналған түйіршіктер 1 мл лизис буферінде (1% SDS, 5 мл EDTA, 50 мл Tris pH 8) ерітілді және суық этанол ваннасында 10 цикл бойынша 100% амплитудамен UP50H sonicator (Hielscher, Teltow, Германия). Хроматиннің фрагментациясы 1% агароздық гельде көрінді. Алынған фрагменттер 200-500pb диапазонында болды. Еріген хроматин Ультрадыбыспен алынған үлгілерді 14000 г 50 ° C кезінде 10 минутта центрифугалау арқылы алынды. Ерітілген фракция разбавление буферінде (1% Triton X-100, 2 mM EDTA, 20 mM Tris pH 8, 150 mM NaCl) 1/10 мөлшерінде сұйылтылған, содан кейін алкилирленіп, қолданғанға дейін 80 ° C температурасында сақталады. (Rodriguez және т.б., 2008)

Құрылғы Қуаты [W] Түрі Көлемі [мл]
VialTweeter 200 бөлек 0.5 1.5
UP50H 50 немесе қолма-қол 0.01 250
UP100H 100 немесе қолма-қол 0.01 500
Uf200 ः T 200 немесе қолма-қол 0.1 1000
UP200St 200 аяқталды 0.1 1000
UP400St 400 аяқталды 5.0 2000 ж
CupHorn 200 CupHorn, sonoreactor 10 200
GDmini2 200 ластаусыз ағындық жасуша

Ақпараттық сұрау




Біздің ескеріңіз құпиялылық саясаты.


Hielscher's VialTweeter көптеген үлгілерді мезгілде дайындауға арналған

VialTweeter ультрадыбыстық үлгі дайындау үшін

Бізбен хабарласыңы! / Алам!

Қосымша ақпарат сұраңыз

Сіз ультрадыбыстық гомогенизациясы туралы қосымша ақпаратты сұратуға келсе, төмендегі нысанды пайдаланыңыз. Біз сіздің талаптарға сай ультрадыбыстық жүйесін ұсынамыз қуанышты боламыз.









Біздің ескеріңіз құпиялылық саясаты.


Әдебиеттер / әдебиеттер

  • Baselet P., Wegrzyn G., Enfors S.-O., Gabig-Ciminska M. (2008): Enterohemorrhagic Escherichia coli (EHEC) бойынша ДНҚ чиптерінің массивтеріне негізделген талдау. Микробтық жасушалар зауыттары 7:29. 2008 ж.
  • Рубцов, Риганти Ч., Воена С., Костамагна С., Алдиери Э., Пескармона Г., Гиго Д., Бозия А. (008): RhoA Silencing адам колонының рак клеткаларында Доксорубицинге қарсылығын қалпына келтіреді. Молекулярлы ісік зерттеулері 6 (10), 2008.
  • Fredlund E., Gidlund A., Olsen M., Börjesson T., Spliid NHH, Simonsson M. (2008): Мицилиядан және бидайдан Fusarium ДНҚ-ны нақты уақыт бойынша ПТР санын анықтау және микотоксиндер деңгейіне . Микробиологиялық әдістері журналы 2008 ж.
  • Фрицше С., Сит М., Вайиль Н., Бритлинг Р., Поль Х.-Д. (2007): Leishmania tarentolae - рекомбинантты ақуыздарға арналған жаңа өрнек жүйесін дамытудың мінез-құлқын сипаттау. Негізгі микробиология журналы 47, 2007. 384-393.
  • Ristola M., Arpiainen S., Saleem MA, Mathieson PW, Welsh GI, Lehtonen S., Holthöfer H. (2009 ж.): Neph3 геніндегі podocytes-да реттеу - NF-κB және Sp1 транскрипция факторларының негізгі рөлі. BMC Молекулярлық Биология 10:83, 2009.
  • Rodriguez J., Vives L., Jorda M., Morales C., Munoz M., Vendrell E., Peinado MA (2008): Металлдандырылмаған ДНК-ның геномдық бақылауын қалыпты және рак клеткаларында қайталайды. Нуклеин қышқылдары бойынша зерттеулер. 36, № 3, 2008. 770-784.
  • Weiske J. Huber O. (2006): Гистидиннің трибагені Протеиннің есітісі1. Ферментінің белсенділігіне тәуелсіз апоптоза. Биологиялық химия журналы. Vol. 281, №37, 2006. 27356-27366.


Біле Worth фактілері

Ультрадыбыстық / акустикалық кавитация кристалдану мен жауын-шашын процестеріне ықпал ететін жоғары қарқынды күштерді жасайды (Үлкейту үшін басыңыз!)

Ультрадыбыстық ДНК кесу акустикалық кавитация мен оның гидродинамикалық ысырап күштеріне негізделген