Produzione a ultrasuoni di β-glucani schizofillani altamente purificati

Schizophyallan è un β-glucano fungino con proprietà immunomodulanti. Per avere effetti medicinali altamente attivi, lo schizofillano deve avere un basso peso molecolare per mostrare una migliore biodisponibilità. È stato dimostrato che l'ultrasuonizzazione riduce il peso molecolare dello schizofillano. Come metodo affidabile ed efficace, la sonicazione può essere facilmente applicata per la produzione di schizofillano a basso peso molecolare.

Funghi Schizophyllum

Il fungo Schizophyllum commune contiene il β-glucano schizpphyllan, noto anche come Sizofiran, SPG, Sonifilan, SizofilanLe specie del fungo Schizophyllum crescono in natura su alberi in decomposizione dopo le stagioni delle piogge. I corpi dei frutti vengono raccolti nella stagione secca seguente. Le specie di Schizophyllum sono ricche di composti biochimici come i glucani e sono quindi consumate soprattutto nei paesi tropicali come cibo e medicina. Grazie alle sue proprietà immunomodulanti, antimicotiche, antineoplastiche e antivirali, Schizophyllum commune, conosciuto anche come fungo Splitgill, ha attratto le aziende biotecnologiche e farmaceutiche.
Il polisaccaride schizofillano, noto anche come sizofiran, sonifilan, o sizofilan, è il principale β-glucano che si trova nei funghi Schizophyllum, che offrono il bioattivo β-glucano schizofillano altamente efficace.
I funghi Schizophyllum commune crescono in natura sugli alberi, il micelio può anche essere coltivato in brodo di fermentazione. Per le applicazioni farmaceutiche e cosmetiche, lo schizofillano a basso peso molecolare è molto più efficace dello schizofillano ad alto peso molecolare. Ciò è dovuto al fatto che lo schizofillano a basso peso molecolare mostra una biodisponibilità e tassi di assorbimento significativamente migliori. Inoltre, lo schizofillano ad alto peso molecolare è spesso problematico nelle applicazioni in quanto comporta un'elevata viscosità delle sue soluzioni acquose.
La riduzione delle dimensioni ad ultrasuoni è una tecnica altamente efficace e affidabile per abbassare il peso molecolare dello schizofillano, aumentando così la qualità della molecola di β-glucano.

Richiesta informazioni





Processore a ultrasuoni UIP2000hdT per la riduzione dimensionale dello schizofillano (sizofiran, SPG, sonifilan, sizofilan).

L'ultrasuoni UIP2000hdT è stato utilizzato con successo per ridurre il peso molecolare dello schizofillano, un β-glucano fungino

Protocollo per la produzione di Schizophyllan a basso peso molecolare

Poiché lo schizofillano a peso molecolare dimostra una biodisponibilità e proprietà applicative drasticamente migliori, il team di ricerca di Smirnou ha studiato l'ultrasuoni per la scissione e la riduzione delle dimensioni della molecola di β-glucano schizofillano.

Ultrasuonizzazione dello Schizofillano

Il β-1.3(1.6)-Glucano schizofillano (SPG) è stato prodotto dalla coltivazione sommersa del fungo S. commune in bioreattore usando saccarosio come substrato.
Dopo la fine della coltivazione, il brodo di coltura è stato diluito con acqua demineralizzata fino alla concentrazione di schizofillana 2 g/L e ultrasuoni con il Processore ad ultrasuoni UIP2000hdT (Hielscher Ultrasonics GmbH, Germania) in modalità di riciclo con i seguenti parametri e condizioni: flusso medio 50 mL/s, frequenza 20 kHz, potenza 2000 W, sonotrodo tipo BS2d22, booster tipo B2-1.4 e ampiezza 100%. La temperatura del brodo di coltura all'inizio della sonicazione era di 25°C. Il brodo di coltura ultrasuonato (input di energia specifica 100 Ws/mL) è stato filtrato attraverso il filtro di profondità Seitz HS800 sotto una pressione di 1,5 bar a 40°C. Lo schizofillano ultrasonico (uSPG) per la caratterizzazione chimica è stato precipitato dal filtrato con una quantità tripla di alcool isopropilico a temperatura di laboratorio, e asciugato a 60°C per 12 ore. Le soluzioni uSPG per gli studi immunologici sono state preparate come segue: (1) il filtrato di brodo di coltura ultrasuoni è stato diafiltrato attraverso 0,1m2 Pall Centramate T-series PES cassette (100 kDa cut-off) a 0,8 bar e diafiltrazione continuato fino a conducibilità retentato era 20 μS / cm; (2) la soluzione è stata concentrata per diafiltrazione alla concentrazione uSPG 1 g / L e sterilizzato in autoclave a 120 ° C / 20 min. L'uSPG denaturato è stato preparato in modo simile, tranne che NaOH è stato aggiunto al filtrato del brodo di coltura in concentrazione 0,2 M e la soluzione alcalinizzata è stata incubata per 30 minuti a temperatura di laboratorio prima della diafiltrazione.

Metodi analitici

La resa del micelio è stata stimata gravimetricamente: il brodo di coltura è stato diluito con acqua 1:4, centrifugato 10000 × g a 25°C per 20 minuti, il precipitato è stato lavato con una quantità tripla di acqua, asciugato a 60°C e pesato. Lo schizofillano è stato precipitato dal surnatante con una quantità tripla di alcool isopropilico, essiccato a 60°C per 24 ore e la sua resa è stata determinata gravimetricamente. La pO2 nel brodo di coltura è stata misurata dalla sonda ottica Hamilton-Visiferm DO 120 (Hamilton, Svizzera).
La viscosità dinamica del brodo di coltura è stata misurata su HAAKE Visco Tester 6L con mandrini 1L e 2L a 4°C e velocità di rotazione di 30 rpm. La velocità di filtrazione è stata calcolata dal tempo di filtrazione di 500 mL di brodo di coltura attraverso un filtro di profondità Seitz HS800 (Pall, USA) da 200 × 200 mm a 1,5 bar di pressione e 40°C.
Il peso molecolare di uSPG è stato misurato mediante SEC-MALLS sul sistema HPLC Alliance (Waters) con colonne PL aquagel OH60 e PL aquagel OH40 collegate in serie, e il rivelatore miniDAWN TREOS (Wyatt) è stato concentrato per diafiltrazione alla concentrazione di uSPG 1 g/L e sterilizzato in autoclave a 120°C/20 min. L'uSPG denaturato è stato preparato in modo simile, tranne che NaOH è stato aggiunto al filtrato del brodo di coltura in concentrazione 0,2 M e la soluzione alcalinizzata è stata incubata per 30 minuti a temperatura di laboratorio prima della diafiltrazione.

Riduzione ultrasonica del peso molecolare del β-glucano schizofillano fungino (Sizofiran, SPG, Sonifilan, Sizofilan)

UIP2000hdT per la riduzione del peso molecolare della schizofillana


L'ultrasuonazione è un metodo altamente efficace per la produzione di schizofillano a basso peso molecolare di grado farmaceutico.

ultrasonoro UP400St (400W, 24kHz) per la lavorazione dello schizofillano

Risultati
Il trattamento ad ultrasuoni è stato applicato direttamente al brodo di coltura di S. commune 144-h con micelio per facilitare la lavorazione a valle della SPG.
Caratteristiche dello Schizofillano sonorizzato: Lo schizofillano ultrasonico (uSPG) è stato precipitato dal filtrato del brodo di coltura con l'alcol e caratterizzato. SEC-MALLS ha stimato che il Mw di uSPG è di circa 1 MDa. Il peso molecolare medio dello schizofillano dalla fermentazione liquida è di circa 5 MDa, mentre nella coltivazione allo stato solido può arrivare fino a 10 MDa. Confrontando il peso molecolare dello schizofillano sottoposto a ultrasuoni con i pesi molecolari dello schizofillano nativo non trattato, si può osservare un peso molecolare ridotto da 5 a 10 volte a causa dell'ultrasuonizzazione.
Il polisaccaride uSPG sonicato conteneva lo 0,7%w/w di proteine e l'1,0%w/w di residui dopo l'accensione. L'idrolizzato uSPG consisteva di glucosio con più del 99%. I risultati analitici indicano che la sonicazione taglia la spina dorsale del β-glucano in modo casuale e i rami laterali rimangono intatti riducendo così la dimensione e il peso molecolare dello schizofillano. Gli studi immunologici su uSPG essenzialmente privi di proteine e di endotossine hanno dimostrato che lo schizofillano a basso peso molecolare sottoposto a ultrasuoni ha una pronunciata attività immunomodulante.

L'ultrasuonazione è applicata con successo per ridurre il peso molecolare dello schizofillano scindendo la molecola tramite cavitazione acustica.

Immagine AFM (in alto) e profilo topografico (in basso) dello schizofillano nativo ultrasonicato. Misurazione in modalità semi-contatto con risoluzione 512 × 512 pxs2. Condizioni: rivestimento in oro, costante di molla 15,3 N/m, angolo di cono della punta <22°.

Viscosità ridotta: L'ultrasuonazione ha portato a una diminuzione significativa della viscosità del brodo di coltura. Durante l'ultrasuonazione, la viscosità del brodo di coltura è cambiata in modo non lineare: la diminuzione della viscosità è stata rapida all'inizio dell'ultrasuonazione, ma in seguito è rallentata. L'input di energia specifica di 100 Ws/mL era sufficiente a ridurre la viscosità del brodo di coltura di quasi 7 volte.

L'ultrasuonatore UIP2000hdT è utilizzato per ridurre efficacemente le dimensioni del composto fungino schizofillano

Ultrasuoni del brodo di coltura di S.commune, ottenuto dalla coltivazione del fungo nel bioreattore per 144 ore. Effetto del periodo di ultrasuoni (espresso come input di energia specifica in Ws/mL) sulla velocità di filtrazione in profondità del brodo di coltura (colonna nera), e sulla concentrazione di schizofillana (SPG) nel filtrato (colonna grigia). Condizioni di ultrasuoni: Processore a ultrasuoni UIP2000hd (20 kHz, 2000W), sonotrodo BS2d22, booster B2-1.4, ampiezza 100%, portata 50 mL/s.
(immagine e studio: ©Smirnou et al., 2017)

Filtrazione migliorata: Il brodo di coltura trattato con ultrasuoni scorreva attraverso il filtro più velocemente del brodo di coltura non trattato (input di energia specifica 0 Ws/mL) con SPG ad alto contenuto molecolare. Inoltre, l'ultrasuonazione ha ridotto significativamente la perdita di prodotto durante la filtrazione. Il filtrato del brodo di coltura non trattato con SPG alto-molecolare (input di energia specifica 0 Ws/mL) conteneva 0,3 ± 0,07 g/L SPG, mentre la concentrazione di SPG prima della filtrazione profonda era di 2 g/L. Al contrario, il filtrato della coltura ultrasonorizzata a 100 Ws/mL conteneva entrambi SPG in concentrazione 2,2 ± 0,2 g/L, che corrisponde a una perdita di prodotto quasi nulla.

La sonicazione migliora significativamente lo shizophyllan.

Ultrasuoni del brodo di coltura di S.commune, ottenuto dalla coltivazione del fungo nel bioreattore per 144 ore. Effetto del periodo di ultrasuoni (espresso come input di energia specifica in Ws/mL) sulla velocità di filtrazione in profondità del brodo di coltura (colonna nera), e sulla concentrazione di schizofillana (SPG) nel filtrato (colonna grigia). Condizioni di ultrasuoni: Processore a ultrasuoni UIP2000hd (20 kHz, 2000W), sonotrodo BS2d22, booster B2-1.4, ampiezza 100%, portata 50 mL/s.
(immagine e studio: ©Smirnou et al., 2017)

L'ultrasuonazione è usata per ridurre il peso molecolare dello schizofillano, un composto bioattivo derivato dal fungo

Immagine AFM (in alto) e profilo topografico (in basso) di schizofillano denaturato ad ultrasuoni. Misurazione in modalità semi-contatto con risoluzione 512 × 512 pxs2. Condizioni: rivestimento in oro, costante di molla 15,3 N/m, angolo di cono della punta < 22°.
(immagine e studio: ©Smirnou et al., 2017)

Richiesta informazioni





Conclusione: Nella loro conclusione, il team di ricerca riassume che il trattamento ad ultrasuoni è una tecnologia efficace per la produzione di schizofillano a basso peso molecolare, che può essere utilizzato in cosmetica e in medicina. L'ultrasuonazione, quando applicata al brodo di coltura completo con micelio, porta alcuni vantaggi alla produzione di schizofillano. Riduce le perdite di prodotto durante la lavorazione a valle e rende possibile la produzione di polisaccaridi altamente purificati grazie all'uso efficiente dell'ultrafiltrazione.
Inoltre, i ricercatori hanno scoperto che il trattamento ad ultrasuoni della schizofillana è facilmente scalabile. Un'unità del disintegratore a ultrasuoni UIP2000hdT dell'impianto pilota ha elaborato 1 litro di brodo di coltura in 110 s in modalità flusso. La produttività del sistema può essere facilmente aumentata con il collegamento sequenziale di ulteriori unità a ultrasuoni.

Attrezzatura a ultrasuoni ad alte prestazioni per l'elaborazione del glucano fungino

Il UIP4000hdT è un potente mixer in linea a ultrasuoni da 4000 watt.La frammentazione di polisaccaridi come i glucani e altri composti bioattivi come la chitina e il chitosano può essere eseguita in modo affidabile con le apparecchiature a ultrasuoni ad alte prestazioni della Hielscher. I nostri ultrasuonatori sono in grado di fornire ampiezze elevate, offrono un controllo preciso dei parametri di processo e possono essere utilizzati 24 ore su 24, 7 giorni su 7, sotto un carico pesante e in ambienti difficili. La gamma di apparecchiature Hielscher Ultrasonics soddisfa questi requisiti in modo affidabile. Oltre alle eccezionali prestazioni degli ultrasuoni, gli ultrasuonatori Hielscher vantano un'elevata efficienza energetica, che rappresenta un significativo vantaggio economico – specialmente quando sono impiegati nella produzione commerciale su larga scala.
Gli ultrasuonatori Hielscher sono sistemi ad alte prestazioni che possono essere equipaggiati con accessori come sonotrodi, booster, reattori o celle di flusso per soddisfare in modo ottimale le vostre esigenze di processo.Con il display digitale a colori, la possibilità di preimpostare i cicli di sonicazione, la registrazione automatica dei dati su una scheda SD integrata, il controllo remoto tramite browser e molte altre caratteristiche, sono garantiti il massimo controllo del processo e la facilità d'uso. Abbinati alla robustezza e alla grande capacità di carico, i sistemi a ultrasuoni Hielscher sono il vostro cavallo di battaglia affidabile nella produzione.La riduzione del peso molecolare dei β-glucani come lo schizofillano richiede potenti ultrasuoni per ottenere la scissione mirata e un prodotto schizofillano finale di alta qualità, che può essere utilizzato per applicazioni farmaceutiche.

La tabella seguente fornisce un'indicazione della capacità di lavorazione approssimativa dei nostri ultrasuoni:

Volume di batch Portata Dispositivi raccomandati
1 - 500mL 10 - 200mL/min UP100H
10 - 2000mL 20 - 400mL/min UP200Ht, UP400St
0,1 - 20L 0,2 - 4L/min UIP2000hdT
10 - 100L 2 - 10L/min UIP4000hdT
n.a. 10 - 100L/min UIP16000
n.a. più grande cluster di UIP16000

Contattaci! / Chiedi a noi!

Richiedi maggiori informazioni

Si prega di utilizzare il modulo sottostante per richiedere ulteriori informazioni sui processori ad ultrasuoni, le applicazioni e il prezzo. Saremo lieti di discutere il vostro processo con voi e di offrirvi un sistema ad ultrasuoni che soddisfi le vostre esigenze!









Si prega di notare il nostro informativa sulla privacy.


Gli omogeneizzatori a ultrasuoni ad alto potere di taglio sono utilizzati in laboratorio, su banco, in processi pilota e industriali.

Hielscher Ultrasonics produce omogeneizzatori ad ultrasuoni ad alte prestazioni per applicazioni di miscelazione, dispersione, emulsificazione ed estrazione in laboratorio, pilota e su scala industriale.



Letteratura / Referenze

Particolarità / Cose da sapere

Schizophyllan – Un β-glucano fungino

Lo schizofillano, noto anche come sizofiran, SPG, sonifilan, sizofilan, è un polisaccaride extracellulare neutro prodotto dal fungo Schizophyllum commune Fries, una specie di fungo basidiomicete. Lo schizofillano è un beta-D-glucano solubile, il cui esatto meccanismo d'azione non è ancora del tutto chiarito, ma questo specifico β-glucano mostra effetti immunomodulanti e antitumorali. Anche se l'esatto meccanismo d'azione del sizofiran non è stato ancora completamente chiarito, questo agente sembra stimolare il sistema immunitario aumentando la produzione di citochine, attivando i macrofagi e le cellule di Langerhans e potenziando l'attività dei leucociti polimorfonucleati (PML) e delle cellule natural killer (NK). Sizofiran è stato trovato piuttosto inefficace contro il cancro gastrico, ma ha esteso il tempo di sopravvivenza nei pazienti con cancro alla testa e al collo. Nel cancro della cervice, Sizofiran ha prolungato la sopravvivenza e il tempo alla recidiva per i casi di stadio II ma non di stadio III, e ha mostrato un'efficacia aggiuntiva quando iniettato direttamente nella massa tumorale. Sonifilan è usato come modificatore di risposta biologica (BRM) con la radioterapia per il trattamento del cancro in Giappone. È stato lanciato per il cancro alla cervice nella Corea del Sud nel 1998.


Ultrasuoni ad alte prestazioni! La gamma di prodotti Hielscher copre l'intero spettro, dagli ultrasuoni da laboratorio compatti alle unità da banco fino ai sistemi a ultrasuoni industriali completi.

Hielscher Ultrasonics produce omogeneizzatori a ultrasuoni ad alte prestazioni da laboratorio a dimensione industriale.