Production par ultrasons de β-glucanes schizophyllanes hautement purifiés

Le schizophyllan est un β-glucan fongique possédant des propriétés immunomodulatrices. Pour des effets médicinaux très actifs, le schizophyllan doit avoir un faible poids moléculaire afin de présenter une meilleure biodisponibilité. Il a été prouvé que l'ultrasonication réduit le poids moléculaire du schizophyllan. En tant que méthode fiable et efficace, la sonication peut être facilement appliquée pour la production de schizophyllane de faible poids moléculaire.

Champignons Schizophyllum

Le champignon Schizophyllum commune contient le β-glucan schizpphyllan, également connu sous le nom de Sizofiran, SPG, Sonifilan, SizofilanLes espèces du champignon Schizophyllum poussent dans la nature sur des arbres en décomposition après la saison des pluies. Les fructifications sont récoltées à la saison sèche suivante. Les espèces de Schizophyllum sont riches en composés biochimiques tels que les glucanes et sont donc consommées, surtout dans les pays tropicaux, comme aliment et comme médicament. En raison de ses propriétés immunomodulatrices, antifongiques, antinéoplasiques et antivirales, Schizophyllum commune, également connu sous le nom de champignon Splitgill, a attiré les entreprises biotechnologiques et pharmaceutiques.
Le polysaccharide schizophyllan, également connu sous le nom de sizofiran, sonifilan ou sizofilan, est le principal β-glucan présent dans les champignons Schizophyllum, qui offrent le β-glucan bioactif hautement efficace schizophyllan.
Les champignons Schizophyllum commune poussent dans la nature sur les arbres, le mycellium peut également être cultivé en bouillon de fermentation. Pour les applications pharmaceutiques et cosmétiques, le schizophyllan de faible poids moléculaire est beaucoup plus efficace que le schizophyllan de haut poids moléculaire. Cela est dû au fait que le schizophyllan de faible poids moléculaire présente une biodisponibilité et des taux d'absorption nettement supérieurs. De plus, le schizophyllan de poids moléculaire élevé est souvent problématique dans les applications car il entraîne une viscosité élevée de ses solutions aqueuses.
La réduction de taille par ultrasons est une technique très efficace et fiable pour abaisser le poids moléculaire du schizophyllan, augmentant ainsi la qualité de la molécule de β-glucan.

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Processeur ultrasonique UIP2000hdT pour la réduction de la taille du schizophyllan (sizofiran, SPG, sonifilan, sizofilan).

le appareil à ultrasons UIP2000hdT a été utilisé avec succès pour réduire le poids moléculaire du schizophyllan, un β-glucan fongique.

Protocole de production de schizophyllane de faible poids moléculaire

Étant donné que le schizophyllan de poids moléculaire présente une biodisponibilité et des propriétés d'application nettement supérieures, l'équipe de recherche de Smirnou a étudié l'ultrasonication pour le clivage et la réduction de la taille de la molécule de β-glucan, le schizophyllan.

Ultrasonication du Schizophyllan

Le β-1.3(1.6)-Glucan schizophyllan (SPG) a été produit par la culture submergée du champignon S. commune dans un bioréacteur utilisant le saccharose comme substrat.
Après la fin de la culture, le bouillon de culture a été dilué avec de l'eau déminéralisée jusqu'à une concentration de schizophyllane de 2 g/L et soumis à des ultrasons avec le Appareil de traitement par ultrasons UIP2000hdT (Hielscher Ultrasonics GmbH, Allemagne) en mode recyclage aux paramètres et conditions suivants : débit du milieu 50 mL/s, fréquence 20 kHz, sortie 2000 W, sonotrode type BS2d22, booster type B2-1.4 et amplitude 100%. La température du bouillon de culture au début de la sonication était de 25°C. Le bouillon de culture ultrasonisé (apport d'énergie spécifique de 100 Ws/mL) a été filtré à travers un filtre en profondeur Seitz HS800 sous une pression de 1,5 bar à 40°C. Le schizophyllan ultrasonique (uSPG) pour la caractérisation chimique a été précipité du filtrat avec une triple quantité d'alcool isopropylique à la température du laboratoire, et séché à 60°C pendant 12h. Les solutions d'uSPG pour les études immunologiques ont été préparées comme suit : (1) le filtrat de bouillon de culture soumis à des ultrasons a été diafiltré à travers une cassette PES Pall Centramate série T de 0,1 m2 (seuil de coupure 100 kDa) à 0,8 bar et la diafiltration s'est poursuivie jusqu'à ce que la conductivité du rétentat soit de 20 μS/cm ; (2) la solution a été concentrée par diafiltration jusqu'à une concentration d'uSPG de 1 g/L et stérilisée par autoclavage à 120°C/20 min. L'uSPG dénaturée a été préparée de manière similaire, sauf que du NaOH a été ajouté au filtrat de bouillon de culture à une concentration de 0,2 M et la solution alcalinisée a été incubée pendant 30 min à la température du laboratoire avant la diafiltration.

Méthodes d'analyse

Le rendement en mycélium a été estimé par gravimétrie : le bouillon de culture a été dilué avec de l'eau 1:4, centrifugé à 10000 × g à 25°C pendant 20 min, le précipité a été lavé avec trois fois plus d'eau, séché à 60°C et pesé. Le schizophyllan a été précipité du surnageant avec une triple quantité d'alcool isopropylique, séché à 60°C pendant 24h et son rendement a été déterminé par gravimétrie. La pO2 dans le bouillon de culture a été mesurée par la sonde optique Hamilton-Visiferm DO 120 (Hamilton, Suisse).
La viscosité dynamique du bouillon de culture a été mesurée sur le HAAKE Visco Tester 6L avec des broches 1L et 2L à 4°C et à une vitesse de rotation de 30 rpm. La vitesse de filtration a été calculée à partir du temps de filtration de 500 mL de bouillon de culture à travers un filtre en profondeur Seitz HS800 (Pall, USA) de 200 × 200 mm à une pression de 1,5 bar et à 40°C.
Le poids moléculaire de l'uSPG a été mesuré par SEC-MALLS sur le système HPLC Alliance (Waters) avec des colonnes PL aquagel OH60 et PL aquagel OH40 connectées en série, et le détecteur miniDAWN TREOS (Wyatt) a été concentré par diafiltration jusqu'à une concentration d'uSPG de 1 g/L et stérilisé par autoclavage à 120°C/20 min. L'uSPG dénaturée a été préparée de manière similaire, sauf que du NaOH a été ajouté au filtrat de bouillon de culture à une concentration de 0,2 M et la solution alcalinisée a été incubée pendant 30 min à la température du laboratoire avant la diafiltration.

Réduction par ultrasons du poids moléculaire du β-glucan fongique schizophyllan (Sizofiran,SPG, Sonifilan, Sizofilan)

UIP2000hdT pour la réduction du poids moléculaire du schizophyllan


L'ultrasonication est une méthode très efficace pour la production de schizophyllan de faible poids moléculaire de qualité pharmaceutique.

appareil à ultrasons UP400St (400W, 24kHz) pour le traitement du schizophyllan

Résultats:
Le traitement par ultrasons a été appliqué directement au bouillon de culture 144-h de S. commune avec mycélium pour faciliter le traitement en aval du SPG.
Caractéristiques du Schizophyllan sonicaté : Le schizophyllan ultrasonique (uSPG) a été précipité du filtrat de bouillon de culture par l'alcool et caractérisé. Le SEC-MALLS a estimé que le Mw de l'uSPG était d'environ 1 MDa. Le poids moléculaire moyen du schizophyllan issu de la fermentation liquide est d'environ 5 MDa, tandis que dans la culture à l'état solide, il peut atteindre jusqu'à 10 MDa. En comparant le poids moléculaire du schizophyllan ultrasonisé avec celui du schizophyllan natif non traité, on observe une réduction de 5 à 10 fois du poids moléculaire due à l'ultrasonisation.
Le polysaccharide uSPG soniqué contenait 0,7 % p/p de protéines et 1,0 % p/p de résidus après inflammation. L'hydrolysat uSPG était composé de glucose à plus de 99 %. Les résultats analytiques indiquent que la sonication clive le squelette du β-glucane de façon aléatoire et que les branches latérales restent intactes, réduisant ainsi la taille et le poids moléculaire du schizophyllan. Des études immunologiques sur des uSPG essentiellement exempts de protéines et d'endotoxines ont montré que le schizophyllan ultrasonique de faible poids moléculaire a une activité immunomodulatrice prononcée.

L'ultrasonication est appliquée avec succès pour réduire le poids moléculaire du schizophyllan en clivant la molécule par cavitation acoustique.

Imagerie AFM (en haut) et profil topographique (en bas) du schizophyllan natif ultrasonisé. Mesure en mode semi-contact avec une résolution de 512 × 512 pxs2. Conditions : revêtement en or, constante de ressort 15,3 N/m, angle de cône de pointe <22°.

Viscosité réduite : L'ultrasonication a entraîné une diminution significative de la viscosité du bouillon de culture. Pendant l'ultrasonication, la viscosité du bouillon de culture a changé de façon non linéaire : la diminution de la viscosité était rapide au début de l'ultrasonication, mais elle a ensuite ralenti. L'entrée d'énergie spécifique de 100 Ws/mL était suffisante pour réduire la viscosité du bouillon de culture presque 7 fois.

L'ultrasoniseur UIP2000hdT est utilisé pour réduire efficacement la taille du composé fongique schizophyllan.

Ultrasonication du bouillon de culture de S.commune, qui a été obtenu par la culture du champignon dans le bioréacteur pendant 144h. Effet de la période d'ultrasonication (exprimée en apport d'énergie spécifique en Ws/mL) sur la vitesse de filtration en profondeur du bouillon de culture (colonne noire), et sur la concentration en schizophyllane (SPG) dans le filtrat (colonne grise). Conditions d'ultrasonication : Processeur d'ultrasons UIP2000hd (20 kHz, 2000W)sonotrode BS2d22, booster B2-1.4, amplitude 100%, débit 50 mL/s.
(photo et étude : ©Smirnou et al., 2017)

Filtration améliorée : Le bouillon de culture traité par ultrasons a traversé le filtre plus rapidement que le bouillon de culture non traité (apport d'énergie spécifique de 0 Ws/mL) avec SPG à haut poids moléculaire. En outre, l'ultrasonication a réduit de manière significative la perte de produit pendant la filtration. Le filtrat du bouillon de culture non traité avec de la SPG à haut poids moléculaire (apport d'énergie spécifique de 0 Ws/mL) contenait 0,3 ± 0,07 g/L de SPG, alors que la concentration de SPG avant la filtration en profondeur était de 2 g/L. En revanche, le filtrat de la culture traitée par ultrasons à 100 Ws/mL contenait tous deux de la SPG à une concentration de 2,2 ± 0,2 g/L, ce qui correspond à une perte de produit quasi nulle.

La sonication améliore le shizophyllan de manière significative.

Ultrasonication du bouillon de culture de S.commune, qui a été obtenu par la culture du champignon dans le bioréacteur pendant 144h. Effet de la période d'ultrasonication (exprimée en apport d'énergie spécifique en Ws/mL) sur la vitesse de filtration en profondeur du bouillon de culture (colonne noire), et sur la concentration en schizophyllane (SPG) dans le filtrat (colonne grise). Conditions d'ultrasonication : Processeur d'ultrasons UIP2000hd (20 kHz, 2000W)sonotrode BS2d22, booster B2-1.4, amplitude 100%, débit 50 mL/s.
(photo et étude : ©Smirnou et al., 2017)

L'ultrasonication est utilisée pour réduire le poids moléculaire du schizophyllan, un composé bioactif dérivé du champignon.

Imagerie AFM (en haut) et profil topographique (en bas) du schizophyllan dénaturé par ultrasons. Mesure en mode semi-contact avec une résolution de 512 × 512 pxs2. Conditions : revêtement en or, constante de ressort 15,3 N/m, angle de cône de la pointe < 22°.
(photo et étude : ©Smirnou et al., 2017)

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Conclusion : Dans leur conclusion, l'équipe de recherche affirme que le traitement par ultrasons est une technologie efficace pour la fabrication de schizophyllan de faible poids moléculaire, qui peut ensuite être utilisé en cosmétique et en médecine. L'ultrasonication, lorsqu'elle est appliquée sur un bouillon de culture complet avec mycélium, apporte certains avantages à la production de schizophyllan. Elle réduit les pertes de produit pendant le traitement en aval et permet la production de polysaccharides hautement purifiés grâce à l'utilisation efficace de l'ultrafiltration.
En outre, les chercheurs ont constaté que le traitement par ultrasons du schizophyllan est facilement modulable. Une unité du désintégrateur à ultrasons UIP2000hdT de l'installation pilote a traité 1 litre de bouillon de culture en 110 s en mode flux. La productivité du système peut être facilement augmentée par la connexion séquentielle d'unités à ultrasons supplémentaires.

Équipement ultrasonique haute performance pour le traitement des glucanes fongiques

L'UIP4000hdT est un puissant mélangeur ultrasonique en ligne de 4000 watts.La fragmentation des polysaccharides tels que les glucanes ainsi que d'autres composés bioactifs comme la chitine et le chitosan peut être traitée de manière fiable avec les équipements ultrasoniques haute performance de Hielscher. Nos ultrasons peuvent délivrer des amplitudes élevées, offrent un contrôle précis des paramètres du processus et peuvent fonctionner 24 heures sur 24, 7 jours sur 7, sous une forte charge et dans des environnements exigeants. La gamme d'équipements de Hielscher Ultrasonics répond à ces exigences de manière fiable. En plus d'une performance ultrasonore exceptionnelle, les ultrasons Hielscher sont dotés d'un rendement énergétique élevé, ce qui constitue un avantage économique significatif. – surtout lorsqu'ils sont utilisés pour une production commerciale à grande échelle.
Les ultrasons Hielscher sont des systèmes performants qui peuvent être équipés d'accessoires tels que des sonotrodes, des boosters, des réacteurs ou des cellules d'écoulement afin de répondre de manière optimale aux besoins de votre procédé.L'affichage numérique en couleur, la possibilité de prédéfinir des cycles de sonication, l'enregistrement automatique des données sur une carte SD intégrée, le contrôle à distance par navigateur et bien d'autres fonctions encore garantissent un contrôle optimal du processus et une grande convivialité. Associés à la robustesse et à une forte capacité de charge, les systèmes à ultrasons Hielscher sont votre cheval de bataille en production.La réduction du poids moléculaire des β-glucanes tels que le schizophyllan nécessite des ultrasons puissants pour obtenir le clivage ciblé et un produit final de schizophyllan de haute qualité, qui peut être utilisé pour des applications pharmaceutiques.

Le tableau ci-dessous vous donne une indication de la capacité de traitement approximative de nos ultrasonicators:

lot Volume Débit Appareils recommandés
1 à 500 ml 10 à 200 ml / min UP100H
10 à 2000mL 20 à 400 ml / min UP200Ht, UP400St
0.1 20L 00,2 à 4L / min UIP2000hdT
10 à 100l 2 à 10 L / min UIP4000hdT
n / a. 10 à 100 litres / min UIP16000
n / a. plus grand groupe de UIP16000

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Littérature / Références

Qu'il faut savoir

Schizophyllan – Un β-Glucan fongique

Le schizophyllan, également connu sous le nom de sizofiran, SPG, sonifilan, sizofilan, est un polysaccharide extracellulaire neutre produit par le champignon Schizophyllum commune Fries, une espèce de champignon Basidiomycetes. Le schizophyllan est un bêta-D-glucan soluble, dont le mécanisme d'action exact n'est pas encore totalement élucidé, mais ce β-glucan spécifique présente des effets immunomodulateurs et antitumoraux. Bien que le mécanisme d'action exact du sizofiran ne soit pas encore totalement élucidé, cet agent semble stimuler le système immunitaire en augmentant la production de cytokines, en activant les macrophages et les cellules de Langerhans et en renforçant l'activité des leucocytes polymorphonucléaires (PML) et des cellules tueuses naturelles (NK). Le Sizofiran s'est révélé plutôt inefficace contre le cancer gastrique, mais a prolongé la durée de survie chez les patients atteints de cancer de la tête et du cou. Dans le cas du cancer du col de l'utérus, le Sizofiran a prolongé la survie et le temps jusqu'à la récidive pour les cas de stade II mais pas de stade III, et a montré une efficacité accrue lorsqu'il était injecté directement dans la masse tumorale. Sonifilan est utilisé comme modificateur de réponse biologique (MRB) avec la radiothérapie pour le traitement du cancer au Japon. Il a été lancé pour le cancer du col de l'utérus en Corée du Sud en 1998.


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