Hielscher Ultrasound Technology

Ultrasonic protina pagkuha mula sa mga Tissue at mga kultura ng Cell

  • Pagkuha ng protina ay isang hakbang sa paghahanda ng mahalaga ang sample sa proteomics.
  • Protina ay maaaring nahango mula sa mga halaman at hayop na tissue, yeasts at microorganisms.
  • Sonication ay isang maaasahang, mahusay na mga protina na pamamaraan ng pagkuha na pagbibigay ng mataas na protina na magbubunga sa loob ng panahon ng maikling bunutan.

 

Protina bunutan mula sa tisiyu at mga cell

Pagkuha ng protina mula sa mga tisyu at selula ng pa rin itong pangalagaan ay isang sample ng mahalagang paghahanda hakbang ay isinagawa sa panahon ng maraming biochemical at mapanuring pamamaraan tulad ng ELISA, pahina, Kanlurang blotting, masa na spectrometry, o pagpapadalisay ng protina. Ultrasonic cell pagkagambala, lysis at pagkuha ay isang talaga mapigil na pamamaraan upang matiyak ang mataas na magbubunga ng protina.

Pagkuha ng protina mula sa hayop na tissue

Para sa paghahanda ng sukat ng buong tissue (hal. bato, puso, baga, kalamnan at kung anu-ano pa), tissue dapat ay siniyasat sa maliit na piraso ng malinis na kagamitan, sa yelo kung maaari, at nang mabilis hangga 't maaari upang maiwasan ang marawal na kalagayan ng proteases (hal. lysis buffer tulad ng RIPA o hypotonic lysis buffer na naglalaman protease at phosphatase inhibitor cocktail). Matapos ang dissecting, ang sample ay mailubog sa likido nitrogen para sa snap freeze. Ang sample ay maaaring naka-imbak sa-80 ° C para sa mamaya gamitin o maging keept sa yelo para sa agarang homogenization. Agad bago ultrasonic bunutan, yelo malamig lysis buffer (kasama ng protease inhibitors DTT, leupeptin at aprotinin) ay mabilis na idinagdag sa sampol na tubo (kada ~ 10 mg ng tissue na approx. ~ 600 μL ng buffer ay inirerekomenda). Approx ng 20-60mg ng tissue ay inirerekomenda bawat sampol tube.
Ultrasonic homogenization, lysis at bunutan ay ginanap sa isang ultrasonic homogenizer tulad ng mga UP200Ht o UP200St, nilagyan ng isang micro-tip sonotrode. Tagal ng sonication ay 60-90 sa SEC. sa isang siklo ng ultrasonic mode ng 15 SEC. sonication at 10 SEC pinaglagakan oras. Ang sample ay dapat itago sa yelo lahat ng oras.
Pagkatapos ng ultrasonic homogenization / bunutan, ang lysate ay centrifuged sa 27,000g para sa mga Mehikano sa 20 pagre Afterwards ang supernatent na ito ay nakolekta, kaya na ang konsentrasyon ng protina ay natutukoy sa pamamagitan ng protina na baso tulad ng protina na Pierce baso BCA.

Protina sonication ay isang mahalagang paraan ng sample paghahanda

Ultrasonic protina bunutan mula sa mga cell na may UP200St

Ang mga kahilingan ng impormasyon




Tandaan natin Patakaran sa privacy.


Pagkuha ng protina mula sa suwero ng dugo

Para sa isang homogenous na timpla ng mga suwero at ang pospeyt buffer, ang sample ay vortexed unang bago ultrasonic cell lysis. Para sa ultrasonic lysis, ang sample ay sonicated may isang laboratoryo ng ultrasonic homogenizer tulad ng mga UP100H para sa mga 8 cycles sa 20% malawak, para sa mga kurso ng bawat 5 seconds sa at 15 segundo malayo. Sonocation ay isinasagawa ng sonicationg sa cycle at sa pamamagitan ng paglalagay ng sample sa yelo upang ang isang overheating at thermal marawal na kalagayan ng sample ay iwasan. Dahil ang suwero ay naglalaman ng malaking halaga ng mga protina ng mataas molekular timbang (tulad ng albumin, α1-antitrypsin, transferrin, haptoglobulin, immunoglobulin G at immunoglobulin A), na makagambala sa ang paghihiwalay ng mga protina sa mababang molekular timbang sa panahon ng IEF, ito ay inirerekomenda upang ubusin ang mga ito mula sa suwero na gamit sa isang hanay na dahil sa pagod.

Pagkuha ng protina mula sa mga planta ng tissue

Planta ng sariwang, soft tissue, hal. lumot atbp., ay ay maaaring madaling na masira sa simpleng paglalagay ang sample ng tinadtad na materyales sa lysis buffer para sonication. Matigas, ligenous plant tissue, tulad ng mga binhi, sipres karayom, atbp., ay dapat na tuyo ang lupa. Mahirap ng ilan, ang mga materyales ng makahoy na halaman ay dapat frozen at ground sa likido nitrogen bago nakuha sa pamamagitan ng sonication. Para sa mga plant cell kultura suspensions, isang ultrasonic paggamot sa pagitan ng 30 at 150 na mga segundo sa isang lysis buffer ay halos sapat. Tougher materyal tulad ng mga binhi ng kalabasa ay nangangailangan ng isang mas matinding sonication gaya ng inilalarawan sa ibaba.

Protocol para sa ultrasonic bunutan ng albumin mula sa kalabasang buto

Ultrasonic tissue homogenizer UP400St sa S24d40 - para sa pagkuha ng protina mula sa mga halaman at hayop na tissue (I-click upang palakihin!)Para sa ultrasonic protina pagkuha ng albumin mula sa multa-lupa mga binhi ng kalabasang pulbos, 10 g ng defatted mga binhi ng kalabasang powder at 100 mL ng tubig na deionised sa bilang ng solvent ay idinagdag sa isang 250mL baso basong panglaboratoryo. Ang pagkuha ng protina ay binubuo ng dalawang hakbang: una, ang sample ay sonicated may isang tipo ng probe ultrasonicator UP400St (400W, 24kHz) may inimuntar sonotrode S24d7. Ang basong panglaboratoryo sa baso ay inilagay sa isang paliguan ng tubig na malamig sa panahon ng ultrasonic homogenization. Ang ang setting ng mga ultrasonicator UP400St gamit ang plugable temperatura sensor tiniyak na ang temperatura ng sampol ay lagi nasa ibaba ng 30° C. Pamamagitan ng eksaktong temperatura control sa panahon ng sonication, isang denaturation ng albumin ay iwasan. Ikalawa, ang bunutan ay isinagawa sa isang panghalo sa 200 rpm bilis at sa 30° C. Pagkatapos ang basong panglaboratoryo ay inilipat sa isang thermostatic shaker. Layunin ng paggagamot ay tinanggal via dyalisis ng dalisay na tubig. Matapos ang pagtanggal ng globyulin, ang katas ng protina ay maaaring masuri para sa pagpapasiya ng mga profile ng albumin at sa dakong huli ay nababagay sa pI = 3.0 gamit ang 0.1 M HCl para sa pamumuo ng albumin. Yugto ng solido ay pinaghiwalay sa pamamagitan ng centrifugation sa 5000g, 20° C at redissolved sa deionised na tubig. Pamumuo ng albumin ay isinasagawa nang dalawang beses upang madagdagan ang ratio ng protina sa mga albumin concentrate.

Tumutok ang ultrasonic alkalina protina pagkuha sa paghahanda ng mga protina mula sa rice bran nagpapakita na ang mga resulta ng ultrasonic paggamot sa mataas na protina ay nagbunga sa isang makabuluhang mas maikli oras ng pagkuha – kumpara sa maginoo bunutan pamamaraan.

Ultrasonic aparato VialTweeter para sa pagkuha ng protina mula sa mga sample ng tissue (I-click upang palakihin!)

VialTweeter para sa mga hindi direktang sonication.

Mga pakinabang

  • mabilis
  • mataas na magbubunga
  • lubos na mahusay
  • Tiyak na kontrol sa mga parametro
  • maaaring ipa-photocopy resulta
  • Linear scalability

Halimbawang paghahanda protokol para sa mga functional iNOS enzyme

Upang matamo ang lubos na functional iNOS enzyme (hal. para sa screening ng bawal na gamot), ang sumusunod na protokol ay inirerekomenda: ang cell suspensyon ay dapat na ilagay sa yelo at sonicate sa isang UP100H sa malawak 10µm sa mga mode ng siklo ng 5 SEC. sonication at 25 SEC. magpahinga sa yelo. Ang pamamaraan na ito dapat ulitin approx 3 beses. Ang paglalagakan na oras sa pagitan ng mga cycles ng sonication ay binabawasan ang temperatura tumaas at ay kaya bawasan ang panganib ng denaturation.

Ultrasonic protina Solubilization

Sonication maaaring mapabilis ang protina solubilization proseso, na kung saan ay karaniwang nangangailangan ng ilang oras. Upang hindi na overheat sample at maiwasan ang mga protina marawal na kalagayan at ang mga pagbabago sa mga solusyon na naglalaman ng mga yurya, ang ultrasonic bursts dapat hindi tumagal pa kaysa sa lamang ng ilang segundo.

Ang mga pangkalahatang tagubilin

Kontrol ng temperatura: Upang matiyak ang isang mataas na protina ani nang hindi thermal denaturation, temperatura sa panahon ng pagkuha ay dapat na kontrolado. Ang Hielscher ultrasonic na homogenizers estado ng sining – tinatawag din ang ultrasonic na disintegrator o sonificator – ay talaga mapigil. Dumarating ang mga ito sa isang plugable temperatura sensor. Sa mga setting ng pagpipilian ng mga ultrasonic homogenizer, pinakamataas na temperatura ay maaaring itakda. Kapag naabot ito ni max sa temperatura, ang ultrasonicator awtomatikong tumitigil hanggang sa sample ay cooled.
Buffer: Ang choise ng isang angkop na buffer at ang tamang dami ng buffer ay nag-iiba mula sa tissue sa tissue at dapat ay may korte ang pamamagitan ng pagsubok ng trial at error.
Paghihiwalay / paglilinis: Protina lysates ay maaaring maglaman ng isang labis ng biomolecules tulad ng DNA o carbohydrates, na kung saan ay maaaring alisin sa pamamagitan ng protina ng ulan (deoxycholate-trichloroacetic acid) o palitan ng buffer.

Iniulat ng mga Chittapalo at Noomhorm (2009) na protina ani nadagdagan paggamit ng sonication at iproseso ang ultrasonic tissue homogenization at lysis maari magpatalas umiiral ng mga proseso ng extraction makabuluhang – nagbibigay ng kakayahan para sa mga bagong pagkakataon sa komersyal na bunutan.

Tunog ng proteksiyon kasama ng Hielscher tunog kulungan SPB-L at ultrasonic aparato UP200St. (I-click upang palakihin!)

Ultrasonic tissue homogenizer UP200St para sa mga mahusay na protina pagkuha

Tiyak na kontrol ng ultrasonic paggamot (I-click upang palakihin!)

Mga kontrol ng browser para sa tumpak na operasyon at pagsubaybay ng sonication proseso

Ultrasonic kagamitan para sa pagkuha ng protina

Hielscher Ultrasonics ay nag-aalok ng isang malawak na hanay ng ultrasonic homogenizers para sa pagkakawatak-watak ng mga cell, tisyu, bakterya, microorganisms, lebadura, at kababalaghan.
Hielscher lab ultrasonicators ay mabisa at madaling upang mapatakbo. Binuo para sa mga operasyon ng 24/7, ito ay nilayon bilang matatag at mahusay na lab at upuan-itaas device. Para sa lahat ng device, ang output ng enerhiya at ng malawak ay maaaring tiyakan kinokontrol. Ang malawak na hanay ng mga Mga accessory nagbukas pa setup ang pagpipilian. Ang mga digital na aparato tulad ng VialTweeter, UP200Ht, UP200St, at UP400St may isang integrated temperatura control at isang built-in na SD card para sa automatic na data na pagtatala.
Para sa mga ang hindi direktang, krus-kontaminasyon-libreng at sabay-sabay na sonication ng maramihang sample, nag-aalok kami ng VialTweeter o ang Ultrasonic CupHorn.
Depende sa iyong aplikasyon, materyal, at dami ng sampol, kami ay pinapayo mo ang pinaka-angkop na setup para sa iyong sampol prep. Makipag-ugnay sa amin ngayon!

Makipag-ugnay sa amin! / Itanong sa atin!

Mangyaring gamitin ang form sa ibaba, kung nais mong humiling ng karagdagang impormasyon tungkol sa ultrasonic homogenization. Kami ay natutuwa upang mag-alok sa iyo ng isang ultrasonic sistema na pagtugon ng iyong pangangailangan.









Mangyaring tandaan natin Patakaran sa privacy.


Panitikan/mga reperensya

  • Chittapalo T, Noomhorm A (2009): Ultrasonic tinulungan alkalina pagkuha ng protina mula sa defatted rice bran at ang mga katangian ng mga protina concentrates. Int J pagkain Sci Technol 44:1843 – 1849.
  • Simões, André E.S:; Pereira, Diane M.; Amaral, Joana D.; Nunes, Ana F.; Gomes, Sofia E.; Rodrigues, Pedro M.; Narito, Adrian C.; D'Hooge, Rudi; Steer, Clifford J.; Thibodeau, Stephen N.; Borralho, Pedro M.; Rodrigues, Cecília M.P. (2013): Mahusay pagbawi ng protina mula sa maramihang pinagmulan halimbawa pagkatapos ng trizol o trizol LS RNA bunutan at pangmatagalang pag-iimbak ng pagkain. BMC Genomics 2013, 14:181


Ang mga katotohanan na napakahalagang malaman

Proteomics

Proteomics ay ang mga larangan ng pananaliksik na nag-iimbestiga ng mga protina at mga proteome. Protina fullfil isang malawak na array ng mahahalagang pagganap sa loob ng mga organismo. Ang proteome ay ang buong hanay ng mga protina na nagpahayag ng isang genome, cell, himaymay, o mga organismo sa isang partikular na oras. Ang proteome ay nag-iiba sa oras at magkaibang requirement, o stress, na isang cell o organismo sumasailalim hanapin. Higit pang mga partikular, ito ay ang grupo ng mga protina na ipinahayag sa isang partikular na uri ng cell o organismo, sa isang takdang panahon, sa ilalim ng mga tinukoy na kondisyon. Ang kataga ay isang timpla ng mga protina at genome. Proteomics ay ang pag-aaral ng mga proteome.

Protina

Ang protina ay ang malaking biomolecules, tinatawag macromolecules – na kung saan ay binubuo mula sa isa o mahigit pang mahabang tanikala ng residues ng amino acid. Protina ay naroroon sa lahat ng mga organismo ng parehong vegetal at hayop pinagmulan at ang mga ito ay mahalaga para sa karamihan ng mga biological function. Dahil ang mga protina ay naglalaman ng maraming mga biyolohikal na impormasyon, sila ay nakuha sa analytical na layunin, e.g. para sa mga proteomic pananaliksik. Ang pinakamahalagang function na ginanap sa pamamagitan ng mga protina ay kinabibilangan ng mga catalysis ng metabolic reaksyon, replikasyon ng DNA, bilang tugon sa stimuli, at mga transportasyon ng mga molecule mula sa isang lokasyon sa isa pang. Protina ay naiiba mula sa isa 't isa lalo na sa kanilang pagkakasunod-sunod ng amino acids, na kung saan ay dictated sa pamamagitan ng pagkakasunud-sunod ng nucleotide ng kanilang mga genes, at kadalasan na nauuwi sa protina na natitiklop sa isang partikular na kaayusan ng three-dimensional na tumutukoy sa mga aktibidad na ito. Protina ay – Bukod sa mga peptides – isa sa mga mahahalagang bahagi ng pagkain. Samakatuwid, ang proteomics ay isang mabisang kasangkapan sa pagkain science upang i-optimize ang proseso, kaligtasan sa pagkain at nutritional assessment.

Gel Electrophoresis

Gel electrophoresis ay ang pangunahing pamamaraan para sa paghihiwalay at pagtatasa ng mga macromolecules tulad ng DNA, RNA at mga protina pati na rin ang kanilang mga fragments, batay sa kanilang laki at bayad. Ito ay ginagamit sa clinical chemistry upang ihiwalay ang mga protina sa pamamagitan ng bayad at/o sukat (IEF agarose, mahalagang sukat independent) at sa biochemistry, molecular biology at proteomics na ihiwalay ng isang halo-halong populasyong ng pinagputolputol ng DNA at RNA ng haba, upang tantiyahin ang sukat ng DNA at RNA ng pinagputolputol o ihiwalay ang protina ng bayad.

Mga kultura ng cell

Kultura ng cell ay kinokontrol lumalaking proseso na kung saan ang selula ay nilinang sa ilalim ng kinokontrol na kondisyon. Mga kondisyon sa kultura ng cell ay nag-iiba para sa bawat uri ng cell. Sa pangkalahatan, ang kapaligiran ng isang cell na kultura ay binubuo ng isang angkop na sisidlan (hal. Petri dish) substrate o daluyan na supply ng mga mahahalagang nutrients (amino acids, carbohydrates, bitamina, mineral), paglago kadahilanan, hormones, at gas (CO2, O2), at kumokontrol sa physio-kemikal na kapaligiran (pH buffer, osmotik presyon, temperatura). Karamihan ng mga cell ay kailangan ng isang ibabaw o artipisyal na substrate, habang iba pang mga kultura ng cell ay maaaring nilinang malayang lumulutang sa daluyan ng kultura (kulturang suspensyon, cell suspensyon).
Ginagamit ang mga masa na mga kultura ng mga linya ng animal cell sa pang-industriya produksyon ng viral bakuna at iba pang mga produkto ng biotechnologically galing. Pantao ng mga stem cell ay pa rin itong pangalagaan upang mapalawak ang bilang ng mga cell at iba-iba ang mga selula sa iba 't ibang uri ng somatic cell para sa mga layunin ng paglipat.

Sample ng tissue

Ang terminong tissue ay naglalarawan ng isang cellular intermediate, kung saan ay ang cell na materyal sa isang organisasyon na antas sa pagitan ng mga selula at isang kumpletong organo. Sa tissue, katulad ng mga selula, mula sa parehong pinagmulan na sama-samang isagawa ang isang partikular na function, natitipon. Pamamagitan ng functional pagpapangkat ng maramihang mga tisyu, nabubuo ang masalimuot na istruktura ng mga organo.
Tissue ay masuri para sa mga pananaliksik sa biology, histology/histopathology, parasitology, byokimika, immunohistochemistry pati na upang linangin at kunin ang mga DNA. Maaari ito makilala sa pagitan ng mga hayop (subdibisyon: mammal tissue) at magtanim ng mga tissue. Hayop na tisyu ay nakagrupo sa apat na pangunahing uri ng nag-uugnay, kalamnan, kinakabahan, at epithelial tissue. Planta ng tissue ay binubuo ng mga sumusunod na sistema ng tatlong tissue: ang panlabas, ang mga tissue ng lupa, at ang mga tissue ng tisyung.
Makapaghanda ang mga tissue samples mula sa mga hayop o mga bahagi ng halaman, e.g. ang mga buto, kalamnan, dahon, atbp.

Mga likido ng katawan

Dugo, suwero, plasma, cerebrospinal fluid, laway at synovial likido ang likido sa katawan, na nag-aalok ng isang malaking pinagmumulan ng diagnostically kaugnay na impormasyon. Samakatuwid, ang isang sopistikadong paghahanda ng sampol ng likido sa katawan para sa mga pagsusuri ay mahalaga. Ang unang paghihirap ay nauugnay sa ang malawak na dynamic na hanay ng mga komponent na naroroon sa mga likido ng katawan.

Determinasyon ng konsentrasyon ng protina

Bradford na baso, Lowry na baso at bicinchoninic acid (BCA) baso ay karaniwang assays para matukoy ang konsentrasyon ng mga protina. Ay isa sa mga pinakamadalas gamiting protina sa standard ng baka suwero albumin (BSA).

Lysis Buffer

Lysis buffer ay dapat choosen alinsunod sa mga cell na materyal o tissue (kultura ng tissue, planta, bakterya, fungi, atbp.), at man ng mga selula sa isang istraktura at ang uri ng istraktura. Isang malawak na hanay ng lysis buffer para sa pagkuha ng protina, membranes, at sumasakop sa ay formulated sa isa o mahigit pang mga detergents. Ang sabong ay karaniwang pinili pamamagitan ng trial at error pagsusulit o – Kung magagamit – ayon sa isang umiiral na protina pagkuha protocol. Ang sabong ay kailangang akma sa mga pinagmumulan ng himaymay at mga protina. Sa pangkalahatan, ang mildest sabong panlaba na ay gumagana para sa isang partikular na tissue / protina, ay pinili upang mapanatili ang pinakamalaki na pag-andar ng mga katas. Tangi sa roon, sa kaso ng isang bunutan ng membranes at sumasakop, isang banayad na sabon mapigil ang lamad buo. Karaniwang ginagamit ng detergents sa buffer lysis ay halos nonionic o zwitterionic, hal. CHAPS, deoxycholate, Triton™ X-100, NP40, at 20 ng Tween.
Halimbawa, tisyu gaya ng utak, atay, bituka, bato, lapay, atbp. ay dapat lang buffered sa RIPA – Gayunman protease inhibitors at DTT (hal. sa gel electrophoresis) dapat isama.
Lysis buffer para Gresyang kalamnan tissue (yelo malamig): 20 mM Tris (pH 7.8), 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 1 mM MgCl2, 1% X-100 ng Triton, 10% (w/v) glycerol, 1 mM EDTA, 1 mM dithiothreitol ay pupunan ng protease at phosphatase inhibitor cocktail
Talahanayan ng karaniwang buffer at kanilang pH range. Sa pangkalahatan, ang mga buffer ay karaniwang ginagamit sa konsentrasyon ng 20-50 mM.

Buffer pH hanay
Sitriko acid – NaOH 2.2 – 6.5
Sodium sitrato – Sitriko acid 3.0 – 6.2
Sosa asetato – suka acid 3.6 – 5.6
Cacodylic acid sosa asin – HCl 5.0 – 7.4
MES – NaOH 5.6 – 6.8
Sodium dihydrogen pospeyt – disodium hydrogen pospeyt 5.8 – 8.0mm
Imidazole – HCl 6.2 – 7.8
MOPS – KOH 6.6 – 7.8
Triethanolamine hydrochloride – NaOH 6.8 – 8.8
Tris – HCl 7.0 – 9.0
HEPES – NaOH 7.2 – 8.2
Tricine – NaOH 7.6 – 8.6
Sodium tetraborate – boric acid 7.6 – 9.2
Bicine – NaOH 7.7 – 8.9
Glycine – NaOH 8.6 – 10.6

Karamihan ng buffer magpakita ng pH-pag-asa sa temperatura. Ito ay lalong totoo para sa mga Tris buffer. Ang mga pagbabago sa pKa mula 8.06 sa 25° C sa 8.85 sa 0° C.
(pH at pKa ng isang buffer: pH panukala ang konsentrasyon ng hydrogen ions sa isang solusyon na aqueous. pKa (= acid dissociation pare-pareho) ay isang kaugnay, ngunit mas partikular na panukala, na ito ay tumutulong na hulaan kung paano kikilos ang mga molecule sa pinahahalagahan na nauugnay sa partikular na pH.)

TRIzol

TRIzol ay isang kemikal na solusyon na ginamit upang kunin RNA/DNA/protina sa panahon ng mga guanidinium thiocyanate-Penol chloroform bunutan. Ang paggamit ng ultrasonically na tinulungan ng bunutan ng TRIzol resulta sa mataas na DNA, RNA at mga protina na magbubunga mula sa parehong sampol at nakahihigit sa gayon ng iba pang mga pamamaraan ng pagkuha.