Hielscher Ultrasound Technology

Ultrasonic Lysis ng e. Coli

  • E. coli bakterya ay ang pinaka-karaniwang ginagamit na mga bakterya sa microbiology at biotechnology.
  • Ultrasonic cell disruptors maghatid ng maaasahang at maaaring ipa-photocopy resulta para sa lysis ng e. coli.
  • Matindi pa talaga mapigil cavitation gupitin puwersa at magreresulta sa kumpletong pagkagambala at mataas na bunutan binigyang-daan (hal. mga protina, DNA).

Cell pagkagambala ng Cavitation

Escherichia coli bakterya ay lysed mapagkakatiwlaan gamitin ultrasonic tissue homogenizers.Ultrasonic probe-uri homogenizers makisama sa Mehikano 20,000 na mga cycles kada ikalawang (sa 20kHz) at cavitation dahilan sa mga likido o supsensions. Tunog cavitation mikroskopiko lugar ng pamimilit tulad ng vacuum at mataas na temperatura na wasakin cell. Kahit na ang temperatura ay maaaring maabot ang ilang libong degrees Celsius, cavitation Volume ay napakaliit nila hindi init ng proseso ng makabuluhang. Ang ultratunog ay nakabuo ng tunog cavitation at gupitin pwersa ay magbutas o basagin ang mga cell lamad ng E.coli – depende sa mga setting ng aparato ng mga ultrasonic homogenizer.

Ang mga pakinabang ng Ultrasonic Lysis

  • tiyak na kontrol ng lysis (katindihan, malawak, temperatura)
  • optimal adaption sa partikular na mga halimbawa
  • kontrol ng temperatura
  • para sa mga maliit na sa malaking sampol (µL sa litro)
  • dalisay na mekanikal na paggamot
  • linear scale-up mula sa lab sa produksyon
Ang ultrasonic aparato VialTweeter ay nagpapahintulot para sa paghahanda ng sabay-sabay ang sample ng hanggang sa 10 mangkok sa ilalim ng parehong mga kondisyon ng proseso. (I-click upang palakihin!)

VialTweeter para sa ultrasonic lysis

Ang mga kahilingan ng impormasyon




Tandaan natin Patakaran sa privacy.


Habang kemikal at enzymtic lysis ay maaaring may problema – dahil ang kemikal lysis ay maaaring baguhin ang istraktura ng mga protina at ipakilala ang mga problema ng pagpapadalisay at enzymatic lysis ay nangangailangan ng matagal ng inkubasyon panahon at ay hindi maaaring ipa-photocopy – ultrasonic pagkagambala ay isang paraan ng sopistikadong, mabilis na cell pagkagambala.
Ultrasonic lysis ay batay sa mekanikal na pwersa lamang. Walang kemikal ay idinagdag, sonication break ang cell wall gupitin Forces. Kemikal lysis ay maaaring baguhin ang istraktura ng mga protina at ipakilala ang mga problema ng pagpapadalisay. enzymatic pagkagambala ay nangangailangan ng mahabang inkubasyon panahon at hindi maaaring ipa-photocopy.

Pangkalahatang rekomendasyon

UP400St ultrasonicator sa Reaktor ng daloySonication ay ang pinaka-popular na pamamaraan para sa mga lysing masyadong maliit, katamtaman at malalaking dami ng cell suspensions – mula sa pico-litro hanggang 100 L/hr (gamit ang isang ultrasonic daloy ng cell). Mga cell ay lysed ng likidong gupitin at cavitation. DNA ay din nagupitan ng balahibo sa panahon ng sonication, kaya ito ay hindi kinakailangan upang idagdag ang DNase sa mga cell suspensyon.
Kontrol ng temperatura:
Pamamagitan ng paunang paglamig ng sample at pagtupad ng mga sample sa panahon ng sonication sa yelo, sample thermal na marawal na kalagayan ng sample madaling maiiwasan.
Sa isip, sampol ay dapat panatilihing napakalamig sa lysis, samples ngunit para sa karamihan ito sapat kung ang temperatura hindi makaangat ang temperatura ng kultura o himaymay na pinagmulan. Kaya nga iminumungkahi, upang panatilihin ang suspensyon sa yelo at sonicate kasama ang ilang maikling ultrasonics pulses ng 5-10 seg at huminto ng 10-30 seg. Sa panahon ng huminto, ang init kaya nawawala upang muling itatag ang isang mababang temperatura. Para sa mas malaking cell sample, iba 't ibang daloy ng cell reactors sa paglamig jacket ay magagamit.

Mga protocol para sa paghahanda ng E. Coli Lysates

Pagsusuri ng pagpapahayag at pagdalisay ng recombinant protina

Ang mga pellet ng e. coli ay sonicated may isang ultrasonic sistema UP100H (Hielscher). Para sa layuning ito, ang mga pellet ng cell ay resuspended sa pinalamig lysis buffer (50 mM Tris-HCl pH = 7.5, 100 mM NaCl, 5 mM DTT, 1 mM PMSF) at cooled sa yelo para sa 10 min. Pagkatapos, cell suspensyon ay sonicated may 10 maiikling pansamantalang pagbabaluktot ng 10 s na sinundan ng interval na 30 s para sa paglamig. Sa wakas, tinanggal cell kalat sa ultracentrifugation sa 4° C para sa 15 min sa 14000 rpm. Para sa pagpapatibay ng rPR ekspresyon, ang supernatant ay tumakbo sa 12% polyacrylamide gel at aanalisahin ng SDS-PAGE at Western blotting. Ginawa ang pagpapadalisay ng rPR gamit Ni2 +Mga dagta ng - NTA (Invitrogen, USA) ayon sa manufacturer's guide. Sa yugtong ito, pagpapadalisay ng katutubong pamamaraan ay ginagamit. Ang kadalisayan ng sa purified protina ay tasahin ang paggamit ng mga electrophoresis sa 12% polyacrylamide gel at paglamlam sa kasunod Coomassie asul. Konsentrasyon ng purified protina ay nasusukat sa Micro BCA protina na baso kit (PIERCE, USA). (Azarnezhad et al. 2016)

Ultrasonic cell disruptor UP100H (100W) para sa mga lysis, cell pagkagambala at paggugupit ng DNA.

Ultrasonic homogenizer UP100H (100W)

Cell paglago, Crosslinking at paghahanda ng e. coli Cell Extracts

Para sa mga SeqA at RNA polymerase ChIP Chip E. coli MG1655 o MG1655 ΔseqA ay lumago sa 37° C sa isang OD600 ng tungkol sa mga 0.15 sa 50 ml LB (+ 0.2% glucose) bago 27 μl ng formaldehyde (37%) kada midyum ng ml ay idinagdag (pangwakas na konsentrasyon 1%). Crosslinking ay isinagawa sa mabagal pagyanig (100 rpm) sa temperatura ng kuwarto para sa 20 min na sinundan ng Nagkuha sa 10 ml ng 2.5 M glycine (huling konsentrasyon 0.5 M). Para sa mga eksperimento sa init-shock, e. coli MG1655 ay lumago sa mga midyum ng ml ng 65 LB sa 30° C sa isang OD600 ng mga 0.3. Sa dakong huli ang 30 ml ng kultura ay inilipat sa isang pre napainit flask sa 43° C at ang natitira na iningatan sa 30° C. Crosslinking at Nagkuha si tulad ng inilarawan sa itaas maliban na selula ay pinananatiling nasa 30 o 43 ° C para sa 5 min bago pa mabagal pagyanig sa temperatura ng kuwarto. Selula ay nakolekta sa pamamagitan ng centrifugation at hinugasan doble ng malamig TBS (pH7.5). Matapos resuspension sa lysis ng 1 ml buffer (10 mM Tris (pH 8.0mm), 20% sucrose, 50 mM NaCl, 10 mM EDTA, 10 mg/ml lysozyme) at paglaganap sa 37° C para sa 30 min na sinundan ng Pagdagdag ng 4 ml buffer ng IP, mga cell ay sonicated sa yelo na may 12 beses 30 seg at 30 seg break sa isang UP400St ultrasonic processor (Hielscher Ultrasonics GmbH) may 100% na kapangyarihan. Pagkatapos ng centrifugation para sa 10 min sa 9000 g, 800 μl aliquotes ng mga supernatant ay naka-imbak sa-20 ° C. (Waldminghaus 2010)

Labis na produksyon at pagdalisay ng enzymes.

Para sa mga labis na produksyon ng decahistidine (His10)-tag ng protina, e. coli BL21(DE3) ay transformed sa pET19b constructs. Isang magdamag na preculture ay harvested sa pamamagitan ng centrifugation, at 1% ay ginamit na magbakuna ng isang ekspresyon ng kultura. Ang mga cell na dala ng mga pET19mgtB ay malalaki sa 22° C hanggang isang optical densidad sa 600 nm (OD600) ng 0.7. Ang kultura ay inilipat sa 17° C at sapilitan ng 100 μM IPTG. Pagkatapos ng 16 h, ang kultura ay harvested pamamagitan ng centrifugation sa 7,500 × g sa 4° C. Selula ay resuspended sa 50 mM buffered ng pospeyt saline (PBS) may 0.3 M NaCl sa pH 7.4 at masira ng Ultrasound sa isang S2 micro-tip sonotrode sa mga UP200St ultrasonicator (Hielscher, Teltow, Alemanya) sa isang siklo ng 0.5 at isang malawak ng 75%.
Ang labis na produksyon ng decahistidine tag GtfC ay sapilitan sa 37° C sa isang OD600 ng 0.6 sa 100 μM IPTG. Cell ay pagkatapos ay incubated para sa 4 h, nag-ani at lysed tulad ng nakasaad sa itaas para sa mga MgtB.
Extracts ng magaspang na mga cell ay centrifuged sa 15,000 × g at 4° C sa latak ang kalat ng cell. Ang clarified extracts ay isinasakay sa 1-ml HisTrap FF krudo kolum gamit ang isang sistema ng ÄKTAprime Plus (GE Healthcare). Ang enzymes ay mapapadalisay ayon sa manufacturer's protokol para sa mga gradient elution ng kanyang tag ng mga protina. Mga solusyon ng eluted ng mga protina ay dialyzed dalawang beses laban Volume na 1,000 ng 50 mM PBS, pH 7.4, may 0.3 M NaCl sa 4° C. Ang paglilinis ay nasusuri sa pamamagitan ng 12% SDS-PAGE. Ang konsentrasyon ng mga protina ay natutukoy sa pamamagitan ng Bradford pamamaraan gamit ang Roti-Quant (Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Germany). (Rabausch et al. 2013)

Pagkuha ng protina mula sa bakterya ng e. coli
Isang pain protina ng interes (sa ang kaso, MTV1 ng Arabidopsis thaliana) ay na'to ay nag-buo sa isang tag ng GST at ipinahayag sa mga selula ng BL21 Escherichia coli (e. coli).
1. kumuha ng isang pellet ng GST-MTV1 at GST (naaayon sa bacterial kultura sa 50 ml) at resuspend sa bawat isa sa 2.5 mL yelo malamig bunutan buffer.
2. paggamit ng ultrasonicator UP100H (equipped na may MS3 microtip-sonotrode para sa mga maliliit na Volume (2-5mL)) upang maputol ang bacterial cell hanggang sa sila ay lysed, na kung saan ay nakasaad sa pinababang opacity at ibayong lagkit. Ito ay isasagawa sa yelo, at ito ay inirerekomenda upang sonicate sa agwat (hal. 10 seg sonicating sinundan ng 10 seg sa yelo at kung anu-ano pa). Pangangalaga ay kinuha hindi upang sonicate sa masyadong mataas na iting. Kung pinagbubula o ang pagbubuo ng isang puting ipukol ay natukoy, ang katindihan ay nangangailangan na lowered.
3. transfer lysed bakterya solusyon sa 1.5 mL microcentrifuge tubes at centrifugation sa 4° C, 16,000 x g para sa 20 min.

Binago ng Allicin protina sa e. coli

Ang VialTweeter ay isang komportableng ultrasonicator para sa mga maliliit na sample homogenizationPagpapasiya ng ang mga nilalaman ng Sulfhydryl sa 5, 5 '-Dithiobis(2-nitrobenzoic acid) (DTNB) na baso
Isang magdamag kultura ng e. coli MG1655 ay ginagamit upang magbakuna MOPS dyutay daluyan (1:100). Ang kultura ay lumago ang aerobically hanggang sa marating ang isang A600 ng 0.4. Ang kultura ay nahati sa tatlong 15-ml kultura para sa paggamot ng stress. Isang untreated kultura ay nagsilbi bilang isang negatibong kontrol. 0.79 mM allicin (128 μg ml-1) o 1 mM diamide ay idinagdag sa isa sa mga natitirang cultures dalawa sa bawat isa. Kultura ay incubated sapagkat 15 pagre 5 ml ng bawat kultura ay harvested sa pamamagitan ng centrifugation (8,525 × g, 4° C, 10 min). Hinugasan ang mga selula ng dalawang beses sa 1 ml ng PBS (137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 2 mM KH2PO4pH 7.4, iniimbak ang anaerobically bago gamitin) at centrifuged (13,000 × g, 4 ° C, 10 min). Selula ay resuspended sa lysis buffer (PBS may 6 mM guanidinium HCl, pH 7.4) bago ang pagkagambala sa 4 ° C sa pamamagitan ng Ultrasound (VialTweeter ultrasonicator, Hielscher GmbH, Alemanya) (3 × 1 min). Mga labi ng cell ay pelleted pamamagitan ng centrifugation (13,000 × g, 4 ° C, 15 min). Ang supernatant ay inilipat sa isang 3.5-ml QS-macro cuvette (10 mm) sa isang bar sa magnetic ang kaguluhan at may halong 1 ml ng lysis buffer. Sinusubaybayan ang pagkalipol ng mga halimbawa sa 412 nm sa isang Jasco V-650 spectrophotometer na equipped sa PSC-718-kontrolado ng temperatura ng mga cell mayhawak ng (Jasco) sa temperatura ng kuwarto. 100μl ng isang 3 mM dithiobis (2-nitrobenzoic acid) solusyon ay idinagdag. Pagkalipol ay sinusubaybayan hanggang ito ay umabot sa saturation. Pagkalkula ng thiol konsentrasyon ay isinagawa gamit ang pagkalipol koepisyent ϵ412 13,700 M =-1 cm-1 para sa mga thio-2-nitrobenzoic acid (TNB). Cellular thiol konsentrasyon ay kinakalkula base sa isang volyum ng e. coli selula ng 6.7 × 1015 litro at isang cell densidad ng A600 = 0.5 (katumbas ng 1 × 108 selula ng ml-1 kultura). (Müller et al. 2016)

Sa Vivo Glutathione determinasyon

E.coli MG1655 ay lumago sa MOPS dyutay medium sa isang kabuuang dami ng 200ml hanggang A600 ng 0.5 ay naabot. Ang kultura ay nahati sa mga kultura ng 50-ml para sa paggamot ng stress. Pagkatapos ng inkubasyon sa mga selula ng 0.79 mM allicin, 1 mM diamide, o dimethyl sulfoxide (pagkontrol), sa 15 min ay harvested sa 4,000g sa 4° C sa para sa 10 pagre Cells ay hugasan nang dalawang beses sa KPE buffer bago resuspension ng Bolitas sa 700µl ng KPE buffer. Para sa mga deproteination, 300l ng 10% (w/v) sulfosalicylic acid ay idinagdag bago pagkagambala ng selula ng Ultrasound (3 x 1 min; VialTweeter ultrasonicator). Supernatants ay nakolekta matapos centrifugation (30 min, 13, 000g, 4° C). Sulfosalicylic asido na konsentrasyon ay nabawasan sa 1% sa pamamagitan ng Pagdagdag ng 3 tomo ng KPE buffer. Isinagawa ang mga sukat ng kabuuang glutathione at GSSG na gaya ng inilarawan sa itaas. Konsentrasyon ng cellular glutathione ay kinakalkula base sa isang volyum ng e. coli selula ng 6.7×1015 litro at isang cell densidad ng A600 0.5 (katumbas ng 1×108 selula ng ml-1 kultura). GSH konsentrasyon ay kinakalkula sa pamamagitan ng pagbabawas ng 2 [GSSG] mula sa kabuuang glutathione. (Müller et al. 2016)

Ultrasonic disruptor para sa cell lysis at pagkuha ng biyolohikal na materyal (I-click upang palakihin!)

Probe-uri ultrasonicator UP400St

Pagpapahayag ng tao na mAspAT sa e. coli

Ultrasonic cell disruptor UP400St (400W) para sa pagkuha ng intracellular bagay (hal. mga protina, sumasakop, DNA, RNA atbp.)Ang nag-iisang kolonya ng E. coli BL21 (DE3) nagtatago ang ekspresyon vector sa 30 mL ng Luria-Bertani (LB) katamtaman na naglalaman 100μg/mL ampicillin, at pagkatapos ay nilinang sa 37ºC hanggang sa optical densidad (OD600) umabot sa 0.6. Ang mga selula ay harvested sa pamamagitan ng centrifugation sa 4,000 × g para sa 10 min, at resuspended sa 3L sa sariwang na LB medium na naglalaman ng mga 100μg/mL ampicillin.
Sa dakong huli, ang pagpapahayag ng protina ay sapilitan sa 1 mM isopropyl sa-ᴅ-1-thiogalactopyranoside (IPTG) para sa 20 h sa 16ºC. Ang mga selula ay harvested sa pamamagitan ng centrifugation sa 8,000 × g para sa 15 min at hinugasan ng buffer (20 mM NaH2PO4, 0.5 M NaCl, pH 7.4). Ang mga selula ng sangkapt ng 45g (basa timbang) ay nakuha mula sa 3 L kultura. Pagkatapos ng centrifugation, ang Bolitas na cell ay resuspended sa buffer na napakalamig bunutan ng 40 mL (para sa 1 L kultura) A, at lysed ng Ultrasound sa paggamit ng napakalamig na temperatura ng UP400St instrumento (Dr. Hielscher GmbH, Alemanya). Ang mga cell lysis ay centrifuged sa 12,000 rpm para sa 15 min hiwalay natutunaw (supernatant) at precipitated (pellet) fractions. (Jiang et al. 2015)

Ang table sa ibaba ay nagbibigay sa iyo ng mga indikasyon ng tinatayang processing kapasidad ng ating ultrasonicators:

Dami ng Batch Daloy Rate Rekomendadong mga aparatong
0.5 sa 1.5mL n.a VialTweeter
1 sa 500mL 10 hanggang 200mL/min UP100H
10 sa 2000mL 20 sa 400mL/min UP200Ht, UP400St
0.1 hanggang 20L 0.2 sa 4L/min UIP2000hdT
10 sa 100L 2 sa 10L/min UIP4000
n.a 10 sa 100L/min UIP16000
n.a mas malaki kumpol ng mga UIP16000

Makipag-ugnay sa amin! / Itanong sa atin!

Mangyaring gamitin ang form sa ibaba, kung nais mong humiling ng karagdagang impormasyon tungkol sa ultrasonic homogenization. Kami ay natutuwa upang mag-alok sa iyo ng isang ultrasonic sistema na pagtugon ng iyong pangangailangan.









Mangyaring tandaan natin Patakaran sa privacy.


Panitikan/mga reperensya



Ang mga katotohanan na napakahalagang malaman

E.coli

Escherichia coli (e. coli) ay isang gram-negative, facultatively pinapabuti, hinubog sa pamalo, coliform bacterium ng genus Escherichia na karaniwang matatagpuan sa mga mas mababa bituka ng warm-blooded organismo (endotherms). Mayroong isang malaking bilang ng mga strains ng e. coli (o subtypes) may iba 't ibang katangian. Karamihan mga strains ng e. coli ay hindi nakakapinsala sa mga tao, hal. B at k-12 na himig na karaniwang ginagamit para sa pananaliksik ang mga aplikasyon sa laboratories. Gayunman, ilang himig ay mapanganib at maaaring maging sanhi ng malubhang karamdaman.
E. coli ay gumaganap ng isang mahalagang papel sa makabagong biyolohikal engineering at pang-industriya mikrobiyolohiya magmula sa mga bacteria ay madaling manipulahin. Karaniwang lab application na isali madalas ang paggamit ng e. coli, e.g. upang lumikha ng mga recombinant deoxyribonucleic acid (DNA) o kumilos bilang isang modelo na organismo.
E. coli ay isang lubhang maraming nalalaman na host para sa produksyon ng heterologous protina, at mga sistema sa pagpapahayag ng Makapupung protina ay magagamit upang makabuo ng recombinant protina sa e. coli. Gamit ang plasmids na kung saan pinahihintulutan ang mataas ng antas na pagpapahayag ng protina, genes ay ipinakilala sa mga bakterya, na kung saan ay nagbibigay-daan sa upang makabuo ng gayong mga protina sa mataas na dami sa proseso ng pang-industriya pagbuburo.
E.coli ay ginagamit bilang isang pabrika ng cell upang makabuo ng insulin. Karagdagang aplikasyon isama ang paggamit ng binagong e. coli cell upang bumuo at makabuo ng mga bakuna at immobilised enzymes, upang makabuo ng biofuels, pati na rin para sa mga bioremediation.
Ang pilay na k-12 ay isang mutant na anyo ng e. coli na sobrang nagpapahayag ng mga enzyme na alkalina Phosphatase (mataas na BUNDOK). Pagbago ito ay nangyayari dahil sa isang depekto sa mga gene na patuloy na code para sa enzyme. Kung ang isang gene ay lumilikha ng isang produkto nang walang anumang pagpigil na ito ay kilala bilang constitutive aktibidad. Partikular na mutant form na ito ay ginagamit para sa mga paghihiwalay at pagpapadalisay, ang mga enzyme ng mataas na BUNDOK.

Ultrasonic DNA naggugupit

Ultrasonic gupitin pwersa ay isang karaniwang ginagamit na paraan upang ihiwalay ang selda at masira ang mga hibla ng DNA sa piraso. Tunog cavitation break ang cell na pader at lamad upang kunin ang DNA mula sa mga selula at bumuo ng pinagputolputol ng mga 600 – 800 bp sa haba, na kung saan ay mainam para sa pagsusuri.
Mag-click dito upang malaman ang iba pa tungkol sa ultrasonic homogenizers para sa DNA fragmentation!