Hielscher Ultrasound Technology

Ultrasonic DNA naggugupit

  • Sa panahon ng DNA at RNA naggugupit, DNA molecules ay nasira sa mas maliliit na piraso. DNA / RNA fragmentation ay isa sa mga mahalagang sample prep hakbang na kinakailangan ay lumikha ng aklatan para sa mga susunod na henerasyon sequencing (NGS).
  • Naggugupit sa ultrasonic DNA ay gumagamit ng pwersa ng tunog cavitation labagin ang DNA o RNA sa piraso ng 100 – 5kb bp.
  • Ultrasonic naggugupit ay nagbibigay-daan para sa tumpak na DNA fragmentation at adaption para sa ninanais na haba ng DNA.

 

Ultrasonic DNA naggugupit

Hielscher Ultrasonics ay nag-aalok ng iba 't ibang solusyon na nakabase sa ultratunog para sa DNA, RNA at naggugupit chromatin. Pumili sa pagitan ng probe-uri ultrasonicators (hal. UP100H) para sa direct sonication gamit ang isang microtip, o gamitin ang VialTweeeter o ang ultrasonic na cuphorn para sa mga hindi direktang paghahanda ng DNA ng iba 't ibang sample nang sabay-sabay. Hielscher nag-aalok ng ulirang kagamitan isinasaalang-alang ang iyong mga pangangailangan: panahon na ikaw ay may 1 o hanggang sa 10 sample, Volume mula sa microliter sa mga tomo ng litro – Hielscher ultrasonic processors na makukuha upang matugunan ang iyong mga kinakailangan upang maghanda ng pinagputolputol ng DNA, RNA at chromatin sa tamang haba. Reproducibility, madaling operasyon at tiyak na kontrol ay nagpapahintulot para sa isang maaasahang aklatan para sa mga susunod na henerasyon sequencing.
Sa kaibahan ng enzymatic DNA fragmentation, ultrasonic naggugupit angkop ang pwersa ng dalisay na mekanikal na gupitin nang walang pagdaragdag ng anumang kemikal. Pamamagitan ng tumpak na pagtatakda ng mga parameter ng proseso, ultrasonic naggugupit ng mataas molekular timbang DNA pinagputolputol (plasmid at genomic DNA).
Purified nucleic acids ay maaaring nagagawa dahil bago ang, o pagkatapos ng isang fragmentation hakbang.
Sonication parameter (kapangyarihan, pulso umikot / bursts, panahon at temperatura) ay maaaring kinokontrol nang ligtas sa pamamagitan ng mga setting ng software.

Mga bentahe:

  • tiyak na kontrol
  • sonication cycles at panahon talaga na madaling ibagay sa nais na laki ng DNA
  • mataas molekular timbang DNA ng pinagputolputol
  • kontrol ng temperatura
  • Mabilis na
  • maaaring ipa-photocopy resulta
  • autoclavable
  • iba 't ibang solusyon: Probe-uri, VialTweeter at Cuphorn

Mga protocol para sa Ultrasonic DNA naggugupit

Para sa Chromatin Immunoprecipitation baso

Nang maikli, ang mga selula ay lantay sa 60mm lapad pinggan (400,000 kada ulam) at transfected may RhoA siRNA (tulad ng inilarawan); Pagkaraan ng 72 h, sila ay incubated sa pormaldehayd (huling konsentrasyon, 1%) para sa 10 min sa 37° C na cross-link ang mga protina na DNA. Ang cross-linking na reaksyon ay namamatay sa pagdaragdag ng dami ng ikasampung bahagi ng 1.25 mol/L glycine, pagbibigay ng 125 na mmol/L pangwakas na konsentrasyon. Hinugasan ang mga selula ng dalawang beses sa napakalamig PBS, resuspended sa radioimmunoprecipitation na baso buffer [150 mmol/L NaCl, 1% NP40, 0.5% deoxycholate, 0.1% SDS, 5 mmol/L EDTA, 50 mmol/L Tris-HCl (pH 8.0mm)] na naglalaman ng 1 mmol/L phenylmethylsulfonyl Plurayd, 1 Ag/mL aprotinin, at 1 Ag/mL pepstatin A, at pinananatiling sa ice para sa mga 30 min. Pagkatapos, lysates ng mga cell ay sonicated sa yelo na may isang Hielscher UP200S ultratunog sonicator (3 x 40 s, malawak 40%, siklo 1; Hielscher Ultrasonics GmbH) hanggang sa cross-linked na chromatins ay nagupitan balahibo na nagbubunga ng pinagputolputol ng DNA sa pagitan ng 200 at 1,000 bp. Ikasampung bahagi ng buong lysate ay ginagamit upang quantitate ang halaga ng DNA sa kasalukuyan sa iba 't ibang sample at itinuturing bilang “kabuuang input DNA”. Supernatants ay incubated sa salmon tamud DNA/protina agarose - 50% slurry upang mabawasan ang nonspecific background. Immunoprecipitation ay pagkatapos na magdamag tapos pa sa 4° C sa 5 Ag ng anti-NF puwersahang p65 (troso) o walang antibody (negatibong control). Ang mga supernatants ay pupunan sa 5 mol/L NaCl at pinainit magdamag sa 65° C sa pagnanasang protina-DNA cross-links. Ang immunocomplexes ay lalo pang itinuturing na may DNase - at RNase-libreng proteinase K, at DNA ay purified sa pamamagitan ng Penol/chloroform bunutan at ethanol ulan. PCR ay isinagawa nang may partikular na primers na naaayon sa pagkakasunod-sunod sa loob ng rehiyon ng tagataguyod ng mga gene sa tao iNOS (p1 primer: 5¶-GAGGGCTTTCCCA-GAACCAAG-3¶; p2 primer: GCTGGGCTACTGACCCAG - CAGTTCCAG-3¶). (Doublier et al., 2008)

EGFP-pagpapahayag ng mga pag-aaral

Para sa pagpapahayag ng mga pag-aaral, ang mga recombinant pinagmanahan L. tarentolae p10::F9Begfp1.4dBsat #12 (Jena Bioscience, Alemanya) sa mga gene para sa mga EGFP (Enhanced Green Fluorescent protina), chromosomal ssu isinama, ay nilinang sa iba 't ibang media gaya ng inilarawan dati at bukod pa riyan ay pupunan sa 100 mg l-1 Nourseothricin (Jena Bioscience, Germany). Sa panahon ng paglilinang, sample ng 1 ml ay dinakip, centrifuged (2000 × g, 20° C, 10 min) at hinugasan ng 0.9% NaCl solusyon. Pellet ay resuspended sa buffer (20 mM HEPES, 5 mM EDTA, 2 mM DTT) at magkimkim ng sonification kasama ang ultrasonic processor UP400S (aplikasyon ng enerhiya ∼ 400 Ws). Kalat ng cell ay naalis sa pamamagitan ng centrifugation (6000 × g, 4° C, 5 min) at aanalisahin ng sosa dodecyl sulpate – polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-pahina) sa ilalim ng pagbabawas ng mga kondisyon ayon sa paraan ng Laemmli (1970) sa 12.5% polyacralamide gels. EGFP-pagpapahayag ang sinuri sa balisang kultura. (Fritsche et al. 2007)

Ginamit upang maghanda ng mga EHEC DNA para sa pagsusuri ng iba 't ibang uri ng chip UP100H Hielscher ni

Electrophoretic pagsusuri ng genomic DNA ng E. coli EDL933 sumakop sa 0-15 min Ultrasound. L ay nagpapahiwatig ng hagdan ng DNA. (Basselet et al. 2008)

Ang mga kahilingan ng impormasyon




Tandaan natin Patakaran sa privacy.


Chromatin immunoprecipitation

Ultrasonic cell disruptor UP100H (100W) para sa mga lysis, cell pagkagambala at paggugupit ng DNA.Isinagawa ang chromatin immunoprecipitation baso gamit ang maliit na tilad-ITTM Express (aktibo paksa, Carlsbad, CA, USA) ayon sa mga tagubilin ng manufacturer sa pagbabago. Sandali, differentiated human podocytes ay cross-linked may 1% pormaldehayd para sa 10 min sa temperatura ng kuwarto. Selula ay hinugasan ng napakalamig PBS at ang pagkapirmi reaksyon ay tumigil sa pamamagitan ng pagdaragdag ng 0.125 M glycine para sa 5 min sa temperatura ng kuwarto. Selula ay naghugas muli sa napakalamig PBS at nasimot mula sa ulam na ito. Selula ay pelleted pamamagitan ng centrifugation at resuspended sa mga lysis buffer. Pagkatapos ng centrifugation, pelleted nuclei ay resuspended sa naggugupit buffer, incubated sa yelo para sa mga 30 min at ang chromatin ay nagupitan balahibo ng sonication, hal. UP100H (Hielscher Ultrasonics GmbH, Teltow, Alemanya) sa 25% ng kapangyarihan 5 pulses ng 20 seg bawat sa yelo ang ng pinagputolputol ng tinatayang 200 – 600 bp. Ang sheared na chromatin ay pagkatapos ay centrifuged at ng supernatant ay nakolekta. Para sa mga immunoprecipitations, 60 μl ng chromatin ay incubated may 1 μg ng Sp1 (Biotechnology sa Santa Cruz, Santa Cruz, CA, USA), p65 NF-κB (Abcam, Cambridge, UK) o p50 NF-κB (Abcam) antibodies o may kuneho IgG (Zymed Laboratories, South San Francisco, CA, USA), bilang isang negatibong kontrol, magdamag sa 4° C na may magiliw na pag-ikot. Immunocomplexes nakagapos sa magnetic kuwintas ay nakolekta gamit ang isang magnetic na tumayo, hugasan nang husto, at ang crosslinks ng protina/DNA ay nabaligtad at DNA ay eluted para sa mga real-time na pagtatasa ng PCR. (Ristola et al. 2009)

EHEC DNA paghahanda para sa pagsusuri ng iba 't ibang uri ng chip

Pag-aayos ng mga cell lysates at kinopyang DNAs
Bacterial Bolitas na suspendido sa PBS na ang minimithing huling concentration ay itinuturing na may ultratunog disruptor UP100H (Hielscher GmbH, Alemanya) ay bang mayroong isang microtip na MS1 (1mm sa diameter). Gaano kadalas ang operating 30 kHz at epektibo na output ng kapangyarihan ay 100 W. Sa panahon ng operasyon, sample ay cooled sa isang ice tubig paliguan, halo-halong at centrifuged. Ang sample ay nagagamit para sa daloy ng mga pag-aaral ng cytometry, samantalang para sa paghawak ng kalaunan, sample ay napasailalim sa isang init paggamot (95° C, 5 min). Ang krudo na cell lysates ay naproseso gamit ang isang timpla ng Penol: chloroform: isoamyl alak (25:24:1). Isang pantay na dami ng mix na ito ay idinagdag sa ang lysate sample, ang solusyon ay vortexed masigla para sa 15 s at centrifuged sa 15,000 x g para sa 2 min sa kuwarto temperatura (RT) bandang 22° C. Ang nangungunang aqueous phase na naglalaman ang genomic na DNA ay maingat na pinaghiwalay at nakolekta sa isang bagong matsura Eppendorf tubo.
Sa dakong huli, sample ay sonicated sa fragment ng DNA. Ang mga hakbang ng sonication ay naganap sa parehong kondisyon tulad ng inilarawan sa itaas. Upang suriin ang mga epekto ng fragmentation sa ang genomic na DNA, sample ay nasusuri sa pamamagitan ng paggamit ng agarose gel electrophoresis.
(…) Ang sampol na dati na sonicated para sa 2.5 min ay napasailalim sa isang bunutan hakbang pagkatapos ng init paggamot at centrifugation. DNA na inilabas ay nakuha ng dalawang beses sa isang Penol: chloroform: isoamyl na halo ng alak, at pagkatapos ay napasailalim sa pangalawang sonication para sa 0-15 pagre Agarose gel electrophoresis ay ginagamit upang matukoy ang sukat ng pamamahagi ng DNA na napasailalim sa katatapos lamang na bunutan ultrasonic fragmentation (igos. itaas kanan). Kitang-kita ang mataas na hiwa-hiwalay DNA mula sa harapan ng isang DNA lanit sa halip na mataas molekular timbang gapos na inalis mula sa mga sample ay sonicated para sa min na 2.5 o mas matagal. Unti-unting nabawasan na sonication fragment haba na tinatayang 150 – 600 bp, at karagdagang sonication para sa 15 min na binabastos ng mga fragments, gaya ng makikita ang karamihan sa pamamagitan ng ang itaas na bahagi ng ang smear. Sa gayon, ang katamtamang laki ng fragment ng DNA ay unti-unting tinanggihan sa panahon ng Ultrasound at ang paggamot sa 5 min na pinapayagan upang makuha ang laki ng DNA pinagputolputol pinaka-angkop para sa mga chip array assays. Sa wakas, ang pamamaraan ng paghahanda ng DNA analyte na binubuo ng mga unang 2 min ng ultrasonic paggamot, DNA bunutan (2 ×), at kasunod ng 5 min pagkatapos sonication ay itinatag. (Basselet et al. 2008)

Chromatin Immunoprecipitation (ChIP)

Ultrasonic processor UP100H para sa DNA, RNA at chromatin naggugupit. (I-click upang palakihin!)HEK293 mga cell ay cultured tulad ng inilarawan sa itaas at naayos na may 2 mM disuccinimidyl-glutarate para sa 45 min sa temperatura ng kuwarto. Sa dakong huli, ang mga selula ay naghugas nang dalawang beses sa PBS. Cross-linked para sa 10 min sa temperatura ng silid gamit ang pantayin ng 1% (v/v) at hugasan nang dalawang beses sa napakalamig PBS chromatin. Ang cross-linking na reaksyon ay tumigil ng inkubasyon sa glycine sa isang pangwakas na konsentrasyon ng 0.125 M para sa 5 min sa temperatura ng kuwarto. Pagkatapos ng inkubasyon sa trypsin, ang mga selula ay nasimot mula sa mga cell kultura ulam at hinugasan doble ng PBS. Ang mga pellet ng cell ay resuspended sa lysis buffer (5 mM pipa, pH 8.0mm, 85mm KCl, at 0.5% (v/v) Nonidet P-40), incubated sa yelo para sa 10 min, at homogenized sa isang Dounce homogenizer. Sa dakong huli, ang mga nuclei ay pelleted pamamagitan ng centrifugation (3500 x g, 5 min, 4 ° C) at resuspended sa nuclei buffer (50 mM Tris-HCl, pH 8.1, 10 mM EDTA, at 1% (w/v) SDS). Nuclei ay disrupted sa pamamagitan ng sonication may tatlong pulses ng 20-s sa isang UP50H sonicator (Hielscher Ultraschall Technologie) sa isang setting ng cycle 0.5 at malawak 30%, pailalim ang genomic na DNA pinagputolputol sa isang laki ng bulto ng 200 – 1000 bp. Para sa mga ChIP, 50g ng DNA ay diluted na 4-fold sa immunoprecipitation buffer (16.7 mM Tris-HCl, pH 8.1, 167 mM NaCl, 1.2 mM EDTA, 1.1% (v/v) Triton X-100, at 0.01% (w/v) SDS). (Weiske et al. 2006)

Pagsusuri ng pagbabago ng histone sa chromatin immunoprecipitation (ChIP)

Sandali, 6 x 106 selula ay hinugasan doble ng PBS at cross-linked sa kultura na plaka para sa 15 min sa temperatura ng silid na kinaroroonan ng 0.5% pormaldehayd. Cross-linking ang mga reaksyon ay tumigil sa pamamagitan ng pagdaragdag ng mga 0.125 M glycine. Lahat na kasunod na hakbang ay isinagawa sa 48° C. Lahat ng buffer ay pormal na pinalamig at naglalaman ng mga protease inhibitors (kumpletong Mini, Roche). Selula ay hinugasan doble ng PBS at pagkatapos ay nasimot. Bolitas na nakolekta ay dissolved sa lysis ng 1 ml buffer (1% SDS, 5 mM EDTA, 50 mM Tris pH 8) at ay sonicated sa isang paliguan ng malamig na ethanol para sa 10 na mga cycles sa 100% malawak na paggamit ng UP50H sonicator (Hielscher, Teltow, Germany). Chromatin fragmentation ay visualized sa 1% agarose gel. Nakuha ng pinagputolputol ay nasa hanay ng 200 – 500pb. Natutunaw na chromatin ay nakuha sa pamamagitan ng centrifuging ang sonicated sample sa 14,000g para sa 10 min sa 48° C. Ang natutunaw na maliit na bahagi ay diluted 1/10 sa dilusyon buffer (1% Triton X-100, 2 mM EDTA, 20 mM Tris pH 8, 150 mM NaCl) pagkatapos aliquoted at naka-imbak sa 80 ° C hanggang paggamit. (Rodriguez et al. 2008)

Kagamitan Kapangyarihan [W] Uri Dami [mL]
VialTweeter 200 stand-alone 0.5 1.5
UP50H 50 handheld o standmounted 0.01 250
UP100H 100 handheld o standmounted 0.01 500
UP200Ht 200 handheld o standmounted 0.1 1000
UP200St 200 standmounted 0.1 1000
UP400St 400 standmounted 5.0 2000
Cuphorn 200 CupHorn, sonoreactor 10 200
GDmini2 200 kontaminasyon-libreng daloy ng cell

Ang mga kahilingan ng impormasyon




Tandaan natin Patakaran sa privacy.


Hielscher ni VialTweeter ay is´deal para sa sabay-sabay na paghahanda ng maramihang mga halimbawa

VialTweeter para sa mga sample ng ultrasonic prep

Makipag-ugnay sa amin! / Itanong sa atin!

Humingi ng karagdagang impormasyon

Mangyaring gamitin ang form sa ibaba, kung nais mong humiling ng karagdagang impormasyon tungkol sa ultrasonic homogenization. Kami ay natutuwa upang mag-alok sa iyo ng isang ultrasonic sistema na pagtugon ng iyong pangangailangan.









Mangyaring tandaan natin Patakaran sa privacy.


Panitikan/mga reperensya

  • Basselet P., Wegrzyn G., Enfors S.-O., Gabig-Ciminska M. (2008): Sample iproseso para batay sa iba 't ibang uri ng pagtatasa DNA chip ng enterohemorrhagic Escherichia coli (EHEC). Pabrika ng microbial Cell 7:29. 2008.
  • Doublier S., Riganti Ch., Voena C., Costamagna C., Aldieri E., Pescarmona G., Ghigo D., Bosia A. (008): RhoA Silencing Reverts ang pagtutol sa Doxorubicin sa Human Colon Cancer Cells. Magsaliksik ng molekular na kanser sa 6(10), 2008.
  • E. sa Fredlund, Gidlund A., M. sa Olsen, Börjesson T., Spliid N.H.H., Simonsson M. (2008): Paraan ng pagsusuri ng Fusarium DNA bunutan mula mycelia at trigo para sa down-sapa real-time PCR pagbilang at correlation mycotoxin antas. Journal ng Microbiological 2008 ng pamamaraan.
  • C. sa Fritsche, Sitz M., Weiland N., Breitling R., Pohl H.-D. (2007): paglalarawan ng pag-unlad pag-uugali ng mga Leishmania tarentolae – isang bagong sistema ng pagpapahayag para sa mga recombinant protina. Journal ng pangunahing Microbiology 47, 2007. 384 – 393.
  • M. sa Ristola, Arpiainen S., Saleem M. A., Mathieson P. W., Welsh G. I., Lehtonen S., Holthöfer H. (2009): Kadahilanan regulasyon ng Neph3 gene sa podocytes – mahahalagang tungkulin ng transkripsyon NF-κB at Sp1. BMC Molecular Biology 10:83, 2009.
  • Rodriguez J., Vives L., Jorda M., c Morales., M. sa Munoz, Vendrell E., Peinado M. A. (2008): Inuulit ang Genome-malawak na pagsubaybay ng mga unmethylated DNA Alu sa normal at cancer cells. Nucleic Acids Research Tomo 36, blg. 3, 2008 770-784.
  • Weiske J. Huber O. (2006): Histidine Triad protina Hint1 Triggers Apoptosis hiwalay nito Enzymatic Activity. Ang mga Journal ng Biological na chemistry. Tomo 281, blg. 37, 2006. 27356 – 27366.


Ang mga katotohanan na napakahalagang malaman

Ultrasonic / tunog cavitation ay lumilikha ng lubhang matinding pwersa na nagtataguyod ng mga crystallization at ulan na proseso (I-click upang palakihin!)

Naggugupit sa ultrasonic DNA ay nakabatay sa tunog cavitation at pwersa nito hydrodynamic gupitin