Producción por ultrasonidos de β-glucanos de Schizophyllan altamente purificados

El esquizofilano es un β-glucano fúngico con propiedades inmunomoduladoras. Para obtener efectos medicinales altamente activos, el esquizofilano debe tener un peso molecular bajo para mostrar una mejor biodisponibilidad. Se ha demostrado que la ultrasonicación reduce el peso molecular del esquizofilano. Como método fiable y eficaz, la sonicación puede aplicarse fácilmente para la producción de esquizofilano de bajo peso molecular.

Setas Schizophyllum

El hongo Schizophyllum commune contiene el β-glucano schizpphyllan, también conocido como Sizofiran, SPG, Sonifilan, SizofilanLas especies del hongo Schizophyllum crecen en la naturaleza en los árboles en descomposición después de las temporadas de lluvia. Los cuerpos fructíferos se recogen en la siguiente estación seca. Las especies de Schizophyllum son ricas en compuestos bioquímicos como los glucanos, por lo que se consumen especialmente en los países tropicales como alimento y medicina. Debido a sus propiedades inmunomoduladoras, antifúngicas, antineoplásicas y antivirales, el Schizophyllum commune, también conocido como seta de Splitgill, ha atraído a empresas biotecnológicas y farmacéuticas.
El polisacárido esquizofilano, también conocido como sizofiran, sonifilan o sizofilan, es el principal β-glucano que se encuentra en los hongos Schizophyllum, que ofrecen el altamente eficaz β-glucano esquizofilano.
Los hongos Schizophyllum commune crecen en la naturaleza sobre los árboles, el micelio también puede cultivarse en caldo de fermentación. Para aplicaciones farmacéuticas y cosméticas, el esquizofilano de bajo peso molecular es mucho más eficaz que el de alto peso molecular. Esto se debe al hecho de que el esquizofilano de bajo peso molecular muestra una biodisponibilidad y unas tasas de absorción significativamente mejores. Además, el esquizofilano de alto peso molecular suele ser problemático en las aplicaciones, ya que da lugar a una alta viscosidad de sus soluciones acuosas.
La reducción de tamaño por ultrasonidos es una técnica muy eficaz y fiable para reducir el peso molecular del esquizofilano, aumentando así la calidad de la molécula de β-glucano.

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Procesador ultrasónico UIP2000hdT para la reducción del tamaño del esquizofilano (sizofiran, SPG, sonifilan, sizofilan).

el ultrasonicador UIP2000hdT se utilizó con éxito para reducir el peso molecular del esquizofilano, un β-glucano fúngico

Protocolo para la producción de esquizofilano de bajo peso molecular

Dado que el esquizofilano de peso molecular demuestra una biodisponibilidad y unas propiedades de aplicación drásticamente mejores, el equipo de investigación de Smirnou investigó la ultrasonicación para la escisión y la reducción de tamaño de la molécula de β-glucano esquizofilano.

Ultrasonido de Schizophyllan

El β-1.3(1.6)-glucano esquizofilano (SPG) se produjo mediante el cultivo sumergido del hongo S. commune en biorreactor utilizando sacarosa como sustrato.
Una vez finalizado el cultivo, el caldo de cultivo se diluyó con agua desmineralizada hasta alcanzar una concentración de esquizofilano de 2 g/L y se sometió a ultrasonidos con el Procesador ultrasónico UIP2000hdT (Hielscher Ultrasonics GmbH, Alemania) en modo de reciclaje con los siguientes parámetros y condiciones: flujo del medio 50 mL/s, frecuencia 20 kHz, potencia 2000 W, sonotrodo tipo BS2d22, booster tipo B2-1.4 y amplitud 100%. La temperatura del caldo de cultivo al inicio de la sonicación fue de 25°C. El caldo de cultivo ultrasónico (entrada de energía específica de 100 Ws/mL) se filtró a través de un filtro de profundidad Seitz HS800 bajo una presión de 1,5 bares a 40°C. El esquizofilano ultrasónico (uSPG) para la caracterización química se precipitó del filtrado con una cantidad triple de alcohol isopropílico a temperatura de laboratorio, y se secó a 60°C durante 12 horas Las soluciones de uSPG para los estudios inmunológicos se prepararon como sigue (1) el filtrado del caldo de cultivo ultrasónico se diafiltró a través de un casete PES Pall Centramate serie T de 0,1m2 (corte de 100 kDa) a 0,8 bar y se continuó la diafiltración hasta que la conductividad del retentado fue de 20 μS/cm; (2) la solución se concentró por diafiltración hasta una concentración de uSPG de 1 g/L y se esterilizó en autoclave a 120°C/20 min. La uSPG desnaturalizada se preparó de forma similar, salvo que se añadió NaOH al filtrado del caldo de cultivo en concentración 0,2 M y la solución alcalinizada se incubó durante 30 min a temperatura de laboratorio antes de la diafiltración.

Métodos analíticos

El rendimiento del micelio se estimó gravimétricamente: el caldo de cultivo se diluyó con agua 1:4, se centrifugó a 10000 × g a 25°C durante 20 minutos, el precipitado se lavó con triple cantidad de agua, se secó a 60°C y se pesó. El esquizofilano se precipitó del sobrenadante con una cantidad triple de alcohol isopropílico, se secó a 60°C durante 24 horas y su rendimiento se determinó gravimétricamente. La pO2 en el caldo de cultivo se midió con la sonda óptica Hamilton-Visiferm DO 120 (Hamilton, Suiza).
La viscosidad dinámica del caldo de cultivo se midió en el viscosímetro HAAKE 6L con husillos de 1L y 2L a 4°C y velocidad de rotación de 30 rpm. La velocidad de filtración se calculó a partir del tiempo de filtración de 500 mL de caldo de cultivo a través de un filtro de profundidad Seitz HS800 (Pall, EE.UU.) de 200 × 200 mm a 1,5 bares de presión y 40°C.
El peso molecular de la uSPG se midió por SEC-MALLS en el sistema HPLC Alliance (Waters) con columnas PL aquagel OH60 y PL aquagel OH40 conectadas en serie, y el detector miniDAWN TREOS (Wyatt) se concentró por diafiltración hasta una concentración de uSPG de 1 g/L y se esterilizó por autoclave a 120°C/20 min. La uSPG desnaturalizada se preparó de forma similar, excepto que se añadió NaOH al filtrado del caldo de cultivo en concentración 0,2 M y la solución alcalinizada se incubó durante 30 min a temperatura de laboratorio antes de la diafiltración.

Reducción por ultrasonidos del peso molecular del β-glucano fúngico schizophyllan (Sizofiran,SPG, Sonifilan, Sizofilan)

UIP2000hdT para la reducción del peso molecular del esquizofilano


La ultrasonicación es un método muy eficaz para la producción de esquizofilano de bajo peso molecular de calidad farmacéutica.

Ultrasonicador UP400St (400W, 24 kHz) para el procesamiento de esquizofilo

resultados:
El tratamiento de ultrasonidos se aplicó directamente al caldo de cultivo de S. commune 144-h con micelio para facilitar el procesamiento posterior del SPG.
Características del Esquizofilo Sónico: El esquizofilano ultrasónico (uSPG) se precipitó del filtrado del caldo de cultivo mediante alcohol y se caracterizó. La SEC-MALLS estimó que el Mw del uSPG era de alrededor de 1 MDa. El peso molecular medio del esquizofilano procedente de la fermentación líquida es de aproximadamente 5 MDa, mientras que en el cultivo en estado sólido puede alcanzar hasta 10 MDa. Comparando el peso molecular del esquizofilano ultrasónico con los pesos moleculares del esquizofilano nativo no tratado, se puede observar una reducción del peso molecular de 5 a 10 veces debido a la ultrasonificación.
El polisacárido sonicado uSPG contenía un 0,7%w/w de proteínas y un 1,0%w/w de residuos tras la ignición. El hidrolizado de uSPG estaba compuesto por glucosa en más de un 99%. Los resultados analíticos indican que la sonicación escinde la espina dorsal del β-glucano de forma aleatoria y las ramas laterales permanecen intactas, reduciendo así el tamaño y el peso molecular del esquizofilano. Los estudios inmunológicos sobre uSPG esencialmente libre de proteínas y endotoxinas mostraron que el esquizofilano de bajo peso molecular ultrasónico tiene una pronunciada actividad inmunomoduladora.

La ultrasonicación se aplica con éxito para reducir el peso molecular del esquizofilano escindiendo la molécula mediante cavitación acústica.

Imagen de AFM (en la parte superior) y perfil topográfico (en la parte inferior) del esquizofilo nativo ultrasónico. Medición en modo de semicontacto con una resolución de 512 × 512 pxs2. Condiciones: revestimiento de oro, constante de resorte 15,3 N/m, ángulo del cono de la punta <22°.

Viscosidad reducida: La ultrasonicación provocó una disminución significativa de la viscosidad del caldo de cultivo. Durante la ultrasonicación, la viscosidad del caldo de cultivo cambió de forma no lineal: la disminución de la viscosidad fue rápida al principio de la ultrasonicación, pero después se ralentizó. El aporte de energía específica de 100 Ws/mL fue suficiente para reducir la viscosidad del caldo de cultivo casi 7 veces.

El ultrasonido UIP2000hdT se utiliza para reducir eficazmente el tamaño del compuesto fúngico schizophyllan

Ultrasonido del caldo de cultivo de S.commune, obtenido por el cultivo del hongo en el biorreactor durante 144 horas. Efecto del periodo de ultrasonidos (expresado como aporte de energía específica en Ws/mL) sobre la velocidad de filtración en profundidad del caldo de cultivo (columna negra), y la concentración de esquizofilano (SPG) en el filtrado (columna gris). Condiciones de ultrasonido: Procesador de ultrasonidos UIP2000hd (20 kHz, 2000W), sonotrodo BS2d22, booster B2-1.4, amplitud 100%, caudal 50 mL/s.
(imagen y estudio: ©Smirnou et al., 2017)

Filtración mejorada: El caldo de cultivo tratado con ultrasonidos fluyó a través del filtro más rápidamente que el caldo de cultivo no tratado (aporte de energía específica 0 Ws/mL) con SPG de alto peso molecular. Además, la ultrasonicación redujo significativamente la pérdida de producto durante la filtración. El filtrado del caldo de cultivo no tratado con SPG de alto peso molecular (energía específica 0 Ws/mL) contenía 0,3 ± 0,07 g/L de SPG, mientras que la concentración de SPG antes de la filtración en profundidad era de 2 g/L. En cambio, el filtrado del cultivo tratado con ultrasonidos a 100 Ws/mL contenía SPG en una concentración de 2,2 ± 0,2 g/L, lo que corresponde a una pérdida de producto casi nula.

La sonicación mejora significativamente el shizophyllan.

Ultrasonido del caldo de cultivo de S.commune, obtenido por el cultivo del hongo en el biorreactor durante 144 horas. Efecto del periodo de ultrasonidos (expresado como aporte de energía específica en Ws/mL) sobre la velocidad de filtración en profundidad del caldo de cultivo (columna negra), y la concentración de esquizofilano (SPG) en el filtrado (columna gris). Condiciones de ultrasonido: Procesador de ultrasonidos UIP2000hd (20 kHz, 2000W), sonotrodo BS2d22, booster B2-1.4, amplitud 100%, caudal 50 mL/s.
(imagen y estudio: ©Smirnou et al., 2017)

La ultrasonicación se utiliza para reducir el peso molecular del esquizofilano, un compuesto bioactivo derivado del hongo

Imagen de AFM (en la parte superior) y perfil topográfico (en la parte inferior) de esquizofilano desnaturalizado por ultrasonidos. Medición en modo de semicontacto con una resolución de 512 × 512 pxs2. Condiciones: revestimiento de oro, constante de resorte 15,3 N/m, ángulo del cono de la punta < 22°.
(imagen y estudio: ©Smirnou et al., 2017)

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Conclusión: En su conclusión, el equipo de investigación resume que el procesamiento por ultrasonidos es una tecnología eficaz para la fabricación de esquizofilano de bajo peso molecular, que luego puede utilizarse en cosmética y medicina. La ultrasonicación, cuando se aplica al caldo de cultivo completo con micelio, aporta ciertas ventajas a la producción de esquizofilano. Reduce las pérdidas de producto durante el procesamiento posterior y hace posible la producción de polisacáridos altamente purificados gracias al uso eficiente de la ultrafiltración.
Además, los investigadores descubrieron que el procesamiento por ultrasonidos del esquizofilano es fácilmente escalable. Una unidad del desintegrador ultrasónico UIP2000hdT de la planta piloto procesó 1 litro de caldo de cultivo en 110 s en modo de flujo. La productividad del sistema puede aumentarse fácilmente mediante la conexión secuencial de unidades de ultrasonidos adicionales.

Equipo de ultrasonidos de alto rendimiento para el procesamiento de glucano fúngico

El UIP4000hdT es un potente mezclador ultrasónico en línea de 4000 vatios.La fragmentación de polisacáridos como los glucanos, así como de otros compuestos bioactivos como la quitina y el quitosano, puede procesarse de forma fiable con los equipos de ultrasonidos de alto rendimiento de Hielscher. Nuestros equipos de ultrasonidos pueden suministrar altas amplitudes, ofrecen un control preciso sobre los parámetros del proceso y pueden funcionar 24 horas al día, 7 días a la semana, bajo fuertes cargas y en entornos exigentes. La gama de equipos de Hielscher Ultrasonics cumple con estos requisitos de forma fiable. Además de un excelente rendimiento de los ultrasonidos, los ultrasonidos de Hielscher cuentan con una alta eficiencia energética, lo que supone una importante ventaja económica – especialmente cuando se emplea en la producción comercial a gran escala.
Los ultrasonidos de Hielscher son sistemas de alto rendimiento que pueden equiparse con accesorios como sonotrodos, reforzadores, reactores o celdas de flujo para adaptarse a las necesidades de su proceso de forma óptima.Gracias a la pantalla digital en color, la posibilidad de preconfigurar los ciclos de sonicación, el registro automático de datos en una tarjeta SD integrada, el control remoto mediante navegador y muchas otras funciones, se garantiza el máximo control del proceso y la facilidad de uso. Junto con la robustez y la gran capacidad de carga, los sistemas de ultrasonidos de Hielscher son su caballo de batalla fiable en la producción.La reducción del peso molecular de los β-glucanos, como el esquizofilano, requiere potentes ultrasonidos para obtener la escisión deseada y un producto final de esquizofilano de alta calidad, que pueda utilizarse para aplicaciones farmacéuticas.

En la siguiente tabla encontrará algunas indicaciones sobre la capacidad de procesamiento aproximada de nuestros sonicadores:

Volumen del lote Tasa de flujo Dispositivos recomendados
1 a 500 mL 10 a 200 mL/min. UP100H
10 a 2000 mL 20 a 400 mL/min. UP200Ht, UP400St
0,1 a 20 L 0,2 a 4 L/min UIP2000hdT
10 a 100 L 2 a 10 L/min UIP4000hdT
n.a. 10 a 100 L/min UIP16000
n.a. mayor Grupo de UIP16000

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Hielscher Ultrasonics fabrica homogeneizadores ultrasónicos de alto rendimiento para aplicaciones de mezcla, dispersión, emulsificación y extracción a escala de laboratorio, piloto e industrial.



Literatura / Referencias

Información interesante

Schizophyllan – Un β-Glucano fúngico

El esquizofilano, también conocido como sizofiran, SPG, sonifilan, sizofilan, es un polisacárido extracelular neutro producido por el hongo Schizophyllum commune Fries, una especie de hongo de los Basidiomicetos. El sizofilán es un beta-D-glucano soluble, cuyo mecanismo de acción exacto aún no se ha dilucidado del todo, pero este β-glucano específico muestra efectos inmunomoduladores y antitumorales. Aunque el mecanismo de acción exacto del sizofiran aún no se ha dilucidado del todo, este agente parece estimular el sistema inmunitario aumentando la producción de citoquinas, activando los macrófagos y las células de Langerhans y potenciando la actividad de los leucocitos polimorfonucleares (LPM) y las células asesinas naturales (NK). Sizofiran resultó bastante ineficaz contra el cáncer gástrico, pero prolongó el tiempo de supervivencia en pacientes con cáncer de cabeza y cuello. En el cáncer de cuello uterino, Sizofiran prolongó la supervivencia y el tiempo hasta la recidiva en los casos de estadio II, pero no en los de estadio III, y mostró una eficacia añadida cuando se inyectó directamente en la masa tumoral. Sonifilan se utiliza como modificador de la respuesta biológica (MRB) con la radioterapia para el tratamiento del cáncer en Japón. En Corea del Sur se lanzó para el cáncer de cuello de útero en 1998.


Ultrasonidos de alto rendimiento La gama de productos de Hielscher cubre todo el espectro, desde el ultrasonido compacto de laboratorio, pasando por las unidades de sobremesa, hasta los sistemas de ultrasonidos totalmente industriales.

Hielscher Ultrasonics fabrica homogeneizadores ultrasónicos de alto rendimiento de laboratorio a tamaño industrial.