Herstellung von hochgereinigten Schizophyllan-β-Glucanen mit Ultraschall

Schizophyallan ist ein β-Glucan aus Pilzen mit immunmodulatorischen Eigenschaften. Für hochaktive medizinische Wirkungen muss Schizophyllan ein niedriges Molekulargewicht haben, um eine bessere Bioverfügbarkeit zu zeigen. Es ist erwiesen, dass die Ultraschallbehandlung das Molekulargewicht von Schizophyllan verringert. Als zuverlässige und wirksame Methode kann die Beschallung leicht zur Herstellung von Schizophyllan mit niedrigem Molekulargewicht eingesetzt werden.

Schizophyllum-Pilze

Der Pilz Schizophyllum commune enthält das β-Glucan Schizpphyllan, auch bekannt als Sizofiran, SPG, Sonifilan, SizofilanArten des Schizophyllum-Pilzes wachsen in der Natur nach Regenzeiten auf verrottenden Bäumen. Die Fruchtkörper werden in der folgenden Trockenzeit gesammelt. Schizophyllum-Arten sind reich an biochemischen Verbindungen wie Glucanen und werden daher vor allem in tropischen Ländern als Nahrungsmittel und Medizin konsumiert. Aufgrund seiner immunmodulatorischen, antimykotischen, antineoplastischen und antiviralen Eigenschaften hat Schizophyllum commune, auch bekannt als Splitgill-Pilz, das Interesse von Biotech- und Pharmaunternehmen geweckt.
Das Polysaccharid Schizophyllan, auch bekannt als Sizofiran, Sonifilan oder Sizofilan, ist das wichtigste β-Glucan in Schizophyllum-Pilzen, die das hochwirksame bioaktive β-Glucan Schizophyllan enthalten.
Schizophyllum commune-Pilze wachsen in der Natur auf Bäumen, das Mycellium kann auch in Fermentationsbrühe gezüchtet werden. Für pharmazeutische und kosmetische Anwendungen ist Schizophyllan mit niedrigem Molekulargewicht weitaus wirksamer als Schizophyllan mit hohem Molekulargewicht. Dies ist darauf zurückzuführen, dass Schizophyllan mit niedrigem Molekulargewicht eine deutlich bessere Bioverfügbarkeit und Absorptionsrate aufweist. Außerdem ist Schizophyllan mit hohem Molekulargewicht in der Anwendung oft problematisch, da es zu einer hohen Viskosität seiner wässrigen Lösungen führt.
Die Zerkleinerung mit Ultraschall ist eine hochwirksame und zuverlässige Technik zur Verringerung des Molekulargewichts von Schizophyllan, wodurch die Qualität des β-Glucanmoleküls erhöht wird.

Informationen anfordern




Beachten Sie unsere Datenschutzerklärung.


Ultraschallprozessor UIP2000hdT für die Zerkleinerung von Schizophyllan (Sizofiran, SPG, Sonifilan, Sizofilan).

Das Ultraschallgerät UIP2000hdT wurde erfolgreich zur Verringerung des Molekulargewichts von Schizophyllan, einem β-Glucan aus Pilzen, eingesetzt

Protokoll für die Herstellung von Schizophyllan mit niedrigem Molekulargewicht

Da das Molekulargewicht von Schizophyllan eine deutlich bessere Bioverfügbarkeit und Anwendungseigenschaften aufweist, untersuchte das Forscherteam von Smirnou die Ultraschallbehandlung zur Spaltung und Größenreduktion des β-Glucanmoleküls Schizophyllan.

Ultraschallbehandlung von Schizophyllan

β-1.3(1.6)-Glucan Schizophyllan (SPG) wurde durch submerse Kultivierung des Pilzes S. commune in einem Bioreaktor unter Verwendung von Saccharose als Substrat hergestellt.
Nach Beendigung der Kultivierung wurde die Kulturbrühe mit entmineralisiertem Wasser auf eine Schizophyllan-Konzentration von 2 g/L verdünnt und mit dem Ultraschallgerät Ultraschallprozessor UIP2000hdT (Hielscher Ultrasonics GmbH, Deutschland) im Recycle-Modus mit folgenden Parametern und Bedingungen: Mediendurchfluss 50 mL/s, Frequenz 20 kHz, Leistung 2000 W, Sonotrode Typ BS2d22, Booster Typ B2-1.4 und Amplitude 100%. Die Temperatur der Kulturbrühe betrug zu Beginn der Beschallung 25°C. Die beschallte Kulturbrühe (spezifischer Energieeintrag 100 Ws/mL) wurde durch Seitz HS800 Tiefenfilter unter 1,5 bar Druck bei 40°C filtriert. Das ultraschallbehandelte Schizophyllan (uSPG) für die chemische Charakterisierung wurde aus dem Filtrat mit der dreifachen Menge Isopropylalkohol bei Labortemperatur ausgefällt und 12 Stunden lang bei 60°C getrocknet. uSPG-Lösungen für immunologische Untersuchungen wurden wie folgt hergestellt: (1) Das mit Ultraschall behandelte Kulturbrühefiltrat wurde durch eine 0,1 m2 große Pall Centramate T-Serie PES-Kassette (100 kDa cut-off) bei 0,8 bar diafiltriert und die Diafiltration wurde fortgesetzt, bis die Leitfähigkeit des Retentats 20 μS/cm betrug; (2) die Lösung wurde durch Diafiltration auf eine uSPG-Konzentration von 1 g/L konzentriert und durch Autoklavieren bei 120°C/20 min sterilisiert. Denaturiertes uSPG wurde auf ähnliche Weise hergestellt, außer dass dem Kulturbrühefiltrat NaOH in einer Konzentration von 0,2 M zugesetzt wurde und die alkalisierte Lösung vor der Diafiltration 30 Minuten lang bei Labortemperatur inkubiert wurde.

Analytische Methoden

Die Myzelausbeute wurde gravimetrisch bestimmt: Die Kulturbrühe wurde 1:4 mit Wasser verdünnt, 20 Minuten lang bei 25°C mit 10000 × g zentrifugiert, das Präzipitat wurde mit der dreifachen Menge Wasser gewaschen, bei 60°C getrocknet und gewogen. Schizophyllan wurde aus dem Überstand mit der dreifachen Menge Isopropylalkohol ausgefällt, bei 60°C für 24 Stunden getrocknet und die Ausbeute gravimetrisch bestimmt. pO2 in der Kulturbrühe wurde mit der optischen Sonde Hamilton-Visiferm DO 120 (Hamilton, Schweiz) gemessen.
Die dynamische Viskosität der Kulturbrühe wurde auf dem HAAKE Visco Tester 6L mit Spindeln 1L und 2L bei 4°C und einer Rotationsgeschwindigkeit von 30 U/min gemessen. Die Filtrationsgeschwindigkeit wurde aus der Filtrationszeit von 500 mL Kulturbrühe durch einen 200 × 200 mm Seitz HS800 (Pall, USA) Tiefenfilter bei 1,5 bar Druck und 40°C berechnet.
Das uSPG-Molekulargewicht wurde durch SEC-MALLS auf dem HPLC-System Alliance (Waters) mit in Reihe geschalteten PL aquagel OH60 und PL aquagel OH40 Säulen gemessen, und der Detektor miniDAWN TREOS (Wyatt) wurde durch Diafiltration auf eine uSPG-Konzentration von 1 g/L konzentriert und durch Autoklavieren bei 120°C/20 min sterilisiert. Denaturiertes uSPG wurde auf ähnliche Weise hergestellt, mit dem Unterschied, dass NaOH in einer Konzentration von 0,2 M zum Filtrat der Kulturbrühe hinzugefügt und die alkalisierte Lösung vor der Diafiltration 30 Minuten bei Labortemperatur inkubiert wurde.

Verringerung des Molekulargewichts des Pilz-β-Glucans Schizophyllan (Sizofiran, SPG, Sonifilan, Sizofilan) mit Ultraschall

UIP2000hdT zur Verringerung des Molekulargewichts von Schizophyllan


Die Ultraschallbehandlung ist eine hochwirksame Methode zur Herstellung von niedermolekularem Schizophyllan in pharmazeutischer Qualität.

Ultraschallgerät UP400St (400W, 24kHz) für die Verarbeitung von Schizophyllan

Ergebnisse:
Die Ultraschallbehandlung wurde direkt auf die 144-h-Kulturbrühe von S. commune mit Myzel angewandt, um die nachfolgende Verarbeitung von SPG zu erleichtern.
Merkmale von sonifiziertem Schizophyllan: Ultraschallbehandeltes Schizophyllan (uSPG) wurde mit Alkohol aus dem Filtrat der Kulturbrühe ausgefällt und charakterisiert. SEC-MALLS schätzte das Mw von uSPG auf etwa 1 MDa. Das durchschnittliche Molekulargewicht von Schizophyllan aus der Flüssigfermentation beträgt etwa 5 MDa, während es bei der Kultivierung im festen Zustand bis zu 10 MDa erreichen kann. Vergleicht man das Molekulargewicht von ultraschallbehandeltem Schizophyllan mit dem Molekulargewicht von nativem, unbehandeltem Schizophyllan, so lässt sich eine 5- bis 10-fache Verringerung des Molekulargewichts infolge der Ultraschallbehandlung feststellen.
Das beschallte Polysaccharid uSPG enthielt 0,7 % (Gewicht/Gewicht) Protein und 1,0 % (Gewicht/Gewicht) Rückstände nach der Entzündung. uSPG-Hydrolysat bestand zu mehr als 99 % aus Glucose. Die Analyseergebnisse deuten darauf hin, dass die Beschallung das β-Glucan-Grundgerüst willkürlich spaltet und die Seitenäste intakt bleiben, wodurch sich Größe und Molekulargewicht des Schizophyllans verringern. Immunologische Untersuchungen an im Wesentlichen protein- und endotoxinfreiem uSPG zeigten, dass ultraschallbehandeltes Low-Mw-Schizophyllan eine ausgeprägte immunmodulatorische Aktivität aufweist.

Die Ultraschallbehandlung wird erfolgreich zur Verringerung des Molekulargewichts von Schizophyllan eingesetzt, indem das Molekül durch akustische Kavitation gespalten wird.

AFM-Abbildung (oben) und topografisches Profil (unten) von nativem ultraschallbehandeltem Schizophyllan. Messung im Semikontaktmodus mit einer Auflösung von 512 × 512 pxs2. Bedingungen: Goldbeschichtung, Federkonstante 15,3 N/m, Spitzenkonuswinkel <22°.

Reduzierte Viskosität: Die Ultraschallbehandlung führte zu einer deutlichen Abnahme der Viskosität der Kulturbrühe. Während der Ultraschallbehandlung änderte sich die Viskosität der Kulturbrühe nichtlinear: Zu Beginn der Ultraschallbehandlung nahm die Viskosität schnell ab, später verlangsamte sie sich jedoch. Eine spezifische Energiezufuhr von 100 Ws/ml reichte aus, um die Viskosität der Kulturbrühe fast um das 7-fache zu verringern.

Das Ultraschallgerät UIP2000hdT wird zur wirksamen Zerkleinerung der Pilzverbindung Schizophyllan eingesetzt

Ultraschallbehandlung von S.commune-Kulturbrühe, die durch Pilzkultivierung im Bioreaktor für 144 Stunden gewonnen wurde. Auswirkung der Dauer der Ultraschallbehandlung (ausgedrückt als spezifische Energiezufuhr in Ws/ml) auf die Geschwindigkeit der Tiefenfiltration der Kulturbrühe (schwarze Spalte) und die Schizophyllan-Konzentration (SPG) im Filtrat (graue Spalte). Bedingungen der Ultraschallbehandlung: Ultraschallprozessor UIP2000hd (20 kHz, 2000W)Sonotrode BS2d22, Booster B2-1.4, Amplitude 100%, Durchflussrate 50 mL/s.
(Bild und Studie: ©Smirnou et al., 2017)

Verbesserte Filtration: Die ultraschallbehandelte Kulturbrühe floss schneller durch den Filter als die unbehandelte Kulturbrühe (spezifischer Energieeintrag 0 Ws/ml) mit hochmolekularem SPG. Außerdem verringerte die Ultraschallbehandlung den Produktverlust während der Filtration erheblich. Das Filtrat der unbehandelten Kulturbrühe mit hochmolekularem SPG (spezifischer Energieeintrag 0 Ws/mL) enthielt 0,3 ± 0,07 g/L SPG, während die SPG-Konzentration vor der Tiefenfiltration 2 g/L betrug. Im Gegensatz dazu enthielt das Filtrat einer mit 100 Ws/mL ultraschallbehandelten Kultur SPG in einer Konzentration von 2,2 ± 0,2 g/L, was einem Produktverlust von nahezu Null entspricht.

Die Ultraschallbehandlung verbessert Shizophyllan erheblich.

Ultraschallbehandlung von S.commune-Kulturbrühe, die durch Pilzkultivierung im Bioreaktor für 144 Stunden gewonnen wurde. Auswirkung der Dauer der Ultraschallbehandlung (ausgedrückt als spezifische Energiezufuhr in Ws/ml) auf die Geschwindigkeit der Tiefenfiltration der Kulturbrühe (schwarze Spalte) und die Schizophyllan-Konzentration (SPG) im Filtrat (graue Spalte). Bedingungen der Ultraschallbehandlung: Ultraschallprozessor UIP2000hd (20 kHz, 2000W)Sonotrode BS2d22, Booster B2-1.4, Amplitude 100%, Durchflussrate 50 mL/s.
(Bild und Studie: ©Smirnou et al., 2017)

Die Ultraschallbehandlung dient der Verringerung des Molekulargewichts von Schizophyllan, einer bioaktiven Verbindung aus einem Pilz

AFM-Abbildung (oben) und topografisches Profil (unten) von denaturiertem, mit Ultraschall behandeltem Schizophyllan. Messung im Semikontaktmodus mit einer Auflösung von 512 × 512 pxs2. Bedingungen: Goldbeschichtung, Federkonstante 15,3 N/m, Spitzenkonuswinkel < 22°.
(Bild und Studie: ©Smirnou et al., 2017)

Informationen anfordern




Beachten Sie unsere Datenschutzerklärung.


Schlussfolgerung: In ihrer Schlussfolgerung fasst das Forscherteam zusammen, dass die Ultraschallbehandlung eine effiziente Technologie zur Herstellung von Schizophyllan mit niedrigem Molekulargewicht ist, das dann in Kosmetika und in der Medizin verwendet werden kann. Die Ultraschallbehandlung bringt, wenn sie auf eine vollständige Kulturbrühe mit Myzel angewandt wird, bestimmte Vorteile für die Schizophyllanproduktion. Sie verringert die Produktverluste bei der nachgeschalteten Verarbeitung und ermöglicht die Herstellung von hochgereinigtem Polysaccharid durch den effizienten Einsatz der Ultrafiltration.
Außerdem stellten die Forscher fest, dass die Ultraschallverarbeitung von Schizophyllan leicht skalierbar ist. Ein Gerät der Pilotanlage, der Ultraschall-Desintegrator UIP2000hdT, verarbeitete 1 Liter Kulturbrühe in 110 Sekunden im Durchflussmodus. Die Produktivität des Systems kann durch den Anschluss weiterer Ultraschallgeräte leicht gesteigert werden.

Hochleistungs-Ultraschallgeräte für die Verarbeitung von Glucan aus Pilzen

Der UIP4000hdT ist ein 4000 Watt starker Ultraschall-Inline-Mischer.Die Fragmentierung von Polysacchariden wie Glucanen sowie anderen bioaktiven Verbindungen wie Chitin und Chitosan kann mit den Hochleistungs-Ultraschallgeräten von Hielscher zuverlässig durchgeführt werden. Unsere Ultraschallgeräte können hohe Amplituden liefern, bieten eine präzise Kontrollierbarkeit der Prozessparameter und können rund um die Uhr unter hoher Belastung und in anspruchsvollen Umgebungen betrieben werden. Das Geräteprogramm von Hielscher Ultrasonics erfüllt diese Anforderungen zuverlässig. Neben der hervorragenden Ultraschallleistung zeichnen sich die Hielscher Ultraschallgeräte durch eine hohe Energieeffizienz aus, was einen wesentlichen wirtschaftlichen Vorteil darstellt. – insbesondere wenn sie in der kommerziellen Großproduktion eingesetzt werden.
Hielscher-Ultraschallgeräte sind Hochleistungssysteme, die mit Zubehör wie Sonotroden, Boostern, Reaktoren oder Durchflusszellen ausgestattet werden können, um Ihre Prozessanforderungen optimal zu erfüllen.Mit digitalem Farbdisplay, der Möglichkeit zur Voreinstellung von Beschallungsläufen, automatischer Datenaufzeichnung auf einer integrierten SD-Karte, Browser-Fernsteuerung und vielen weiteren Features sind höchste Prozesskontrolle und Bedienerfreundlichkeit gewährleistet. Gepaart mit Robustheit und hoher Belastbarkeit sind Hielscher-Ultraschallsysteme Ihr zuverlässiges Arbeitspferd in der Produktion.Die Reduktion des Molekulargewichts von β-Glucanen wie Schizophyllan erfordert leistungsstarken Ultraschall, um eine gezielte Spaltung und ein hochwertiges Schizophyllan-Endprodukt zu erhalten, das für pharmazeutische Anwendungen genutzt werden kann.

In der folgenden Tabelle finden Sie die ungefähre Verarbeitungskapazität unserer Ultraschallsysteme:

Batch-Volumen Durchfluss Empfohlenes Ultraschallgerät
1 bis 500ml 10 bis 200ml/min UP100H
10 bis 2000ml 20 bis 400ml/min UP200Ht, UP400St
0.1 bis 20l 0,2 bis 4l/min UIP2000hdT
10 bis 100l 2 bis 10l/min UIP4000hdT
n.a. 10 bis 100l/min UIP16000
n.a. größere Cluster aus UIP16000

Kontaktieren Sie uns! / Fragen Sie uns!

Fordern Sie weitere Informationen an!

Bitte verwenden Sie das untenstehende Formular, um zusätzliche Informationen über unsere Ultraschallprozessoren, Anwendungen und Preise anzufordern. Gerne besprechen wir Ihr Verfahren mit Ihnen und bieten Ihnen ein Ihren Anforderungen entsprechendes Ultraschallsystem an!









Bitte beachten Sie unsere Datenschutzerklärung.


Ultraschall-High-Shear-Homogenisatoren werden im Labor, Benchtop, in der Pilotanlage und in der industriellen Verarbeitung eingesetzt.

Hielscher Ultrasonics stellt Hochleistungs-Ultraschallhomogenisatoren für Mischanwendungen, Dispergierung, Emulgierung und Extraktion im Labor-, Pilot- und Industriemaßstab her.



Literatur / Literaturhinweise

Wissenswertes

Schizophyllan – A β-Glucan aus Pilzen

Schizophyllan, auch bekannt als Sizofiran, SPG, Sonifilan, Sizofilan, ist ein neutrales extrazelluläres Polysaccharid, das von dem Pilz Schizophyllum commune Fries, einer Art der Basidiomyceten, produziert wird. Schizophyllan ist ein lösliches Beta-D-Glucan, dessen genauer Wirkmechanismus noch nicht vollständig geklärt ist, aber dieses spezifische β-Glucan zeigt immunmodulatorische und antitumorale Wirkungen. Obwohl der genaue Wirkmechanismus von Sizofiran noch nicht vollständig geklärt ist, scheint dieser Wirkstoff das Immunsystem zu stimulieren, indem er die Zytokinproduktion erhöht, Makrophagen und Langerhans-Zellen aktiviert und die Aktivität polymorphkerniger Leukozyten (PML) und natürlicher Killerzellen (NK) steigert. Sizofiran erwies sich als eher unwirksam gegen Magenkrebs, verlängerte aber die Überlebenszeit bei Patienten mit Kopf- und Halskrebs. Bei Gebärmutterhalskrebs verlängerte Sizofiran die Überlebenszeit und die Zeit bis zum Wiederauftreten bei Fällen im Stadium II, nicht aber im Stadium III, und zeigte zusätzliche Wirksamkeit, wenn es direkt in die Tumormasse injiziert wurde. Sonifilan wird in Japan als biologischer Response Modifier (BRM) zusammen mit einer Strahlentherapie zur Krebsbehandlung eingesetzt. In Südkorea wurde es 1998 für Gebärmutterhalskrebs eingeführt.


Hochleistungs-Ultraschall! Die Produktpalette von Hielscher deckt das gesamte Spektrum vom kompakten Labor-Ultraschallgerät über Tischgeräte bis hin zu vollindustriellen Ultraschallsystemen ab.

Hielscher Ultrasonics fertigt Hochleistungs-Ultraschall-Homogenisatoren vom Labor bis zum voll-kommerziellen Industriemaßstab.