Tecnologia d'ultrasons Hielscher

Ultrasonic extracció de proteïnes de teixit i cèl·lula cultures

  • L'extracció de proteïnes és un pas de preparació de mostres essencial en la proteòmica.
  • Les proteïnes poden ser extrets de plantes i animals de teixit, llevats i microorganismes.
  • La sonicació és un mètode fiable, eficient extracció de proteïna que dóna alts rendiments de proteïnes dins d'un temps d'extracció curt.

 

Extracció de proteïnes a partir de teixits i cèl·lules

L'extracció de proteïnes a partir de teixits i cèl·lules cultivades és un pas de preparació de mostres essencial que es realitza durant moltes tècniques bioquímiques i analítiques com ara ELISA, PAGE, Western Blot, Espectrometria de masses, o la purificació de proteïnes. ultrasònic disrupció cel·lular, lisi i extracció és una tècnica controlable amb precisió per assegurar alts rendiments de proteïnes.

L'extracció de proteïnes a partir de teixit animal

Per a la preparació de teixits de grandària total (per exemple, els ronyons, el cor, el pulmó, el múscul, etc.), el teixit s'ha de disseccionar en peces molt petites amb eines netes, preferiblement al gel, i al més aviat possible per prevenir la degradació per proteasas (p.ex. tampó de lisis com RIPA o tampó de lisis hipotònic que conté un còctel inhibidor de proteasa i fosfatasa). Després de dissecar, la mostra està immersa en nitrogen líquid per congelar-la. La mostra es pot emmagatzemar a -80 ° C per utilitzar-la més tard o ser gelada en gel per obtenir una homogeneïtzació immediata. Immediatament abans de l'extracció ultrasònica, el tampó de lisi gelat (amb inhibidors de la proteasa DTT, leupeptina i aprotinina) s'afegeix ràpidament al tub de mostra (per a ~ 10 mg de teixit aprox. ~ 600 μL de tampó). Aprox. Es recomana 20-60 mg de teixit per tub d'assaig.
homogeneïtzació per ultrasons, la lisi i l'extracció es realitza amb un homogeneïtzador ultrasònic com el UF200 ः t o UP200St, Equipat amb un sonotrodo de micro-punta. durada de la sonicació és de 60-90 seg. en una manera de cicle d'ultrasons de 15 seg. sonicació i 10 seg. temps de descans. La mostra s'ha de mantenir en gel tot el temps.
Després d'ultrasons homogeneïtzació / extracció, el lisat es centrifuga a 27.000 g durant aprox. 20 min. Després es recull el sobrenedant, de manera que la concentració de proteïna es pot determinar per un assaig de proteïna com ara Pierce BCA assaig de proteïnes.

La sonicació de proteïnes és un mètode important de preparació de la Mostra

Extracció de proteïnes ultrasònica a partir de cèl·lules amb UP200St

Sol · licitud d'informació




Tingueu en compte la nostra Política de privacitat.


L'extracció de proteïnes de sèrum de la sang

Per a una barreja homogènia del sèrum i el tampó fosfat, la mostra es torça primer abans de la lisis cel·lular ultrasònica. Per a la lisis ultrasònica, la mostra es sonica amb un homogeneïtzador de laboratori ultrasònic com el UP100H per a 8 cicles a 20% d'amplitud, per a cicles de cada 5 segons encesa i 15 segons apagat. Sonocation es porta a terme per sonicationg en cicles i col·locant la mostra en gel de manera que s'evita un sobreescalfament i la degradació tèrmica de la mostra. Des del sèrum conté una gran quantitat de proteïnes d'alt pes molecular (tals com albúmina, α1-antitripsina, transferrina, haptoglobulin, immunoglobulina G i la immunoglobulina A), que interfereixen amb la separació de proteïnes de baix pes molecular durant la IEF, es recomana per esgotar ells a partir del sèrum utilitzant una columna d'esgotament.

L'extracció de proteïnes a partir de teixit de la planta

El teixit de planta fresca i suau, per exemple, molsa, etc., es pot interrompre fàcilment simplement col·locant el material de mostra picat en el tampó de lisi per sonicació. Els teixits vegetals lleugers, com les llavors, les agulles d'avet, etc., han de ser secs. Alguns materials vegetals duros i llenyosos han de ser congelats i mòlts en nitrogen líquid abans d'extreure's per sonicació. Per a les suspensions de cultiu de cèl · lules vegetals, un tractament ultrasònic entre 30 i 150 segons en un tampó de lisis és, en la seva major part, suficient. Un material més dur, com les llavors de carbassa, requereix una sonicació més intensa tal com es descriu a continuació.

Protocol per a l'extracció per ultrasons de l'albúmina a partir de llavors de carbassa

homogeneïtzador de teixits per ultrasons UP400St amb S24d40 - per a l'extracció de proteïnes de plantes i teixits animals (Feu clic per fer més gran!)Per a l'extracció de proteïnes d'ultrasons de l'albúmina a partir de pols de llavor de carbassa mòlt fi, s'afegeixen 10 g de pols de llavor de carbassa desgreixada i 100 ml d'aigua desionitzada com a dissolvent en un got de precipitats de vidre de 250 ml. L'extracció de la proteïna consisteix en dos passos: En primer lloc, la mostra se sotmet a sonicació amb un ultrasonicador de tipus sonda UP400St (400W, 24 kHz) amb sonotrodo muntat S24d7. El got de precipitats de vidre es col·loca en un bany d'aigua freda durant l'homogeneïtzació ultrasònica. L'ajust de la ultrasonicador UP400St amb el sensor de temperatura capçalable, es va garantir que la temperatura de la mostra sempre es mantingui per sota dels 30 ° C. Pel control de temperatura precís durant la sonicação, s'evita una desnaturalització de l'albúmina. En segon lloc, l'extracció es va realitzar amb un mesclador a una velocitat de 200 rpm ia 30 ° C. Posteriorment, el recipient es transfereix a un coixinet termostàtic. La globulina s'elimina mitjançant diàlisi amb aigua destil·lada. Després de l'eliminació de la globulina, es pot extreure l'extracte de proteïna per determinar el perfil d'albúmina i posteriorment es va ajustar a pI = 3,0 amb HCl 0,1 M per a la coagulació d'albúmina. La fase sòlida es separa per centrifugació a 5000 g, a 20 ° C i es redissolla en aigua desionitzada. La coagulació d'albúmina es duu a terme dues vegades per augmentar la proporció de proteïnes en el concentrat d'albúmina.

Ultrasonic extracció de proteïna alcalina per a la preparació de concentrat de proteïna del segó d'arròs mostra que els resultats del tractament d'ultrasons en un major rendiment de proteïnes en un temps d'extracció significativament més curt – en comparació amb els mètodes d'extracció convencionals.

VialTweeter dispositiu ultrasònic per a l'extracció de proteïnes a partir de mostres de teixit (Feu clic per fer més gran!)

VialTweeter per sonicació indirecta.

avantatges

  • ràpid
  • alts rendiments
  • alta eficiència
  • El control precís dels paràmetres
  • resultats reproduïbles
  • escalabilitat lineal

protocol de preparació de mostres per a l'enzim funcional iNOS

Per obtenir l'enzim plenament funcional iNOS (per exemple, per a la detecció de drogues), es recomana el següent protocol: La suspensió de cèl·lules s'ha de col·locar en gel i se sotmet a ultrasons amb una UP100H en amplitud 10! m en mode de cicle de 5 seg. sonicació i 25 seg. descansar sobre gel. El procediment s'ha de repetir aprox. 3 vegades. El temps de repòs entre cicles de sonicació redueix l'augment de temperatura i per tant reduir el risc de desnaturalització.

La solubilització de proteïnes ultrasònica

La sonicació pot accelerar el procés de solubilització de proteïnes, que normalment requereix diverses hores. Per tal de no sobreescalfar la mostra i evitar la degradació de proteïnes i les modificacions en solucions que contenen urea, les ràfegues d'ultrasons no han de durar més que uns segons.

instruccions generals

Control de temperatura: Per assegurar un alt rendiment de proteïna sense desnaturalització tèrmica, la temperatura durant l'extracció ha de ser controlat. homogeneïtzadors ultrasònics estat-de-art de Hielscher – també anomenat desintegrador ultrasònic o sonificator – són precisament controlable. Vénen amb un sensor de temperatura endollable. A les opcions de configuració del homogeneïtzador d'ultrasons, una temperatura màxima es pot ajustar. Quan s'arriba a aquesta temperatura màxima, la ultrasonicador s'atura automàticament fins que la mostra s'hagi refredat.
buffer: L'elecció d'un tampó adequat i el volum correcte de tampó varia d'un teixit a un altre i ha de ser calculat de sortida mitjançant proves d'assaig i error.
Aïllament / purificació: Proteïna lisats poden contenir un excés de biomolècules com ara ADN o hidrats de carboni, que es poden eliminar per precipitació de proteïnes (àcid desoxicolato-tricloroacètic) o intercanvi de tampó.

Chittapalo i Noomhorm (2009) van informar que el rendiment de proteïna va augmentar usant sonicació i que el procés d'homogeneïtzació del teixit i la lisi per ultrasons pot millorar els processos d'extracció existents significativament – propici per a noves oportunitats comercials d'extracció.

protecció contra el soroll amb el recinte de so de Hielscher SPB-L i dispositiu ultrasònic UP200St. (Feu clic per fer més gran!)

homogeneïtzador de teixit ultrasònic UP200St per a l'extracció de proteïnes eficient

El control precís del tractament ultrasònic (Feu clic per fer més gran!)

control d'explorador per a un funcionament precís i el seguiment del procés de sonicació

Equip ultrasònic per a l'extracció de proteïnes

Hielscher Ultrasons ofereixen una àmplia gamma de homogeneïtzadors ultrasònics per a la desintegració de cèl·lules, teixits, bacteris, microorganismes, llevats i espores.
ultrasonicators laboratori Hielscher són de gran abast i fàcil d'operar. Construïda per a l'operació 24/7, que estan dissenyats com a dispositius de laboratori i de sobretaula robustos i eficients. Per a tots els dispositius, la producció d'energia i l'amplitud poden ser controlats amb precisió. L'àmplia gamma de Accessoris obre noves opcions de configuració. Els dispositius digitals, com ara VialTweeter, UF200 ः t, UP200Sti UP400St tenir un control de temperatura integrat i un incorporat a la targeta SD per a la gravació automàtica de dades.
Per a la indirecta, la contaminació creuada lliure i sonicació simultani de múltiples mostres, oferim la VialTweeter o el cuphorn ultrasònica.
Depenent de l'aplicació, el material i volum de la mostra, anem a recomanar que la configuració més adequada per a la seva preparació de mostres. Poseu-vos en contacte amb nosaltres avui!

Contacti amb nosaltres / Demana'ns!

Utilitzeu el formulari següent, si voleu sol·licitar informació addicional sobre l'homogeneïtzació d'ultrasons. Estarem encantats d'oferir-vos un sistema d'ultrasons que compleixi els vostres requisits.









Tingueu en compte que Política de privacitat.


Literatura / Referències

  • Chittapalo T, Noomhorm A (2009): ultrasònic assistit extracció amb àlcali de la proteïna a partir de segó d'arròs desgreixatge i propietats dels concentrats de proteïna. Int J Food Sci Technol 44: 1843-1849.
  • Simões, André ES:; Pereira, Diane M .; Amaral, Joana D .; Nunes, Ana F .; Gomes, Sofia E .; Rodrigues, Pedro M .; Ho, Adrian C .; D'Hooge, Rudi; Steer, Clifford J .; Thibodeau, Stephen N .; Borralho, Pedro M .; Rodrigues, Cecília MP (2013): Recuperació eficient de proteïnes a partir de múltiples mostres d'origen després de l'extracció de RZ de trizol o trizol i emmagatzematge a llarg termini. BMC Genomics 2013, 14: 181.


Fets que cal saber

proteòmica

La proteòmica és el camp de la investigació que investiga les proteïnes i el proteoma. Les proteïnes respectés una àmplia gamma de funcions vitals dins dels organismes. El proteoma és tot el conjunt de proteïnes expressades per un genoma, cèl·lula, teixit o organisme en un moment determinat. El proteoma varia amb els requisits de temps i diferents, o tensions, que una cèl·lula o organisme pateix. Més específicament, és el conjunt de proteïnes expressades en un tipus donat de cèl·lula o organisme, en un moment donat, en condicions definides. El terme és una barreja de proteïnes i genoma. La proteòmica és l'estudi del proteoma.

proteïna

Les proteïnes són biomolècules són grans, anomenades macromolècules – que es componen d'una o més cadenes llargues de residus d'aminoàcids. Les proteïnes estan presents en tots els organismes d'origen vegetal i animal i són crucials per a la majoria de les funcions biològiques. Atès que les proteïnes contenen molta informació biològica, s'extreuen amb finalitats analítiques, per exemple, per a la investigació proteòmica. La funció més important que realitzen les proteïnes inclou la catàlisi de reaccions metabòliques, la replicació de l'ADN, la resposta als estímuls i el transport de molècules d'un lloc a un altre. Les proteïnes difereixen entre elles principalment en la seva seqüència d'aminoàcids, que es dicta per la seqüència de nucleòtids dels seus gens i que sol donar com a resultat el plegament de proteïnes a una estructura tridimensional específica que determina la seva activitat. Les proteïnes són – A més dels pèptids – un dels components clau dels aliments. Per tant, la proteòmica és una eina poderosa en la ciència dels aliments per optimitzar els processos, seguretat dels aliments i avaluació nutricional.

L'electroforesi en gel

L'electroforesi en gel és el principal mètode per a la separació i l'anàlisi de macromolècules com ara ADN, ARN i proteïnes, així com els seus fragments, en funció de la seva mida i càrrega. S'utilitza en la química clínica per separar proteïnes per la càrrega i / o mida (IEF d'agarosa, essencialment mida independent) i en bioquímica, biologia molecular i la proteòmica per separar una població mixta de fragments d'ADN i ARN per la longitud, per estimar la mida de DNA i fragments d'ARN o per separar proteïnes per la càrrega.

cultius cel·lulars

El cultiu cel·lular és el procés de creixement controlat per mitjà del qual les cèl·lules es cultiven sota condicions controlades. condicions de cultiu cel·lular varien per a cada tipus de cèl·lula. En general, el medi ambient d'un cultiu cel·lular consisteix en un recipient adequat (per exemple placa de Petri) amb substrat o mitjà que subministra els nutrients essencials (aminoàcids, carbohidrats, vitamines, minerals), factors de creixement, hormones, i els gasos (CO2, El2), I regula l'entorn físic-químic (tampó de pH, la pressió osmòtica, temperatura). La majoria de les cèl·lules necessiten una superfície o substrat artificial, mentre que altres cultius de cèl·lules poden ser cultivades lliure surant al mig de cultiu (cultiu en suspensió, suspensió de cèl·lules).
cultius en massa de línies de cèl·lules d'animals s'utilitzen en la producció industrial de vacunes virals i altres productes biotecnològicament derivats. Les cèl·lules mare humanes es cultiven per expandir el nombre de cèl·lules i diferenciar les cèl·lules en diversos tipus de cèl·lules somàtiques amb fins de trasplantament.

Les mostres de teixit

El terme teixit descriu un intermedi cel·lular, en el qual el material cel·lular està en un nivell d'organització entre les cèl·lules i un òrgan complet. En el teixit, cèl·lules similars, del mateix origen que junts dur a terme una funció específica, s'acoblen. Pel agrupament funcional de múltiples teixits, es formen les estructures complexes d'òrgans.
El teixit es van prendre mostres per a la investigació en biologia, histologia / histopatologia, parasitologia, bioquímica, immunohistoquímica, així com per conrear i extreure l'ADN. Es pot distingir entre l'animal (subdivisió: teixit de mamífer) i teixit de la planta. Els teixits animals s'agrupen en els quatre tipus bàsics de connectiu, muscular, nerviós i teixit epitelial. El teixit vegetal es subdivideix en els següents tres sistemes de teixits: l'epidermis, el teixit del sòl, i el teixit vascular.
Les mostres de teixit es poden preparar a partir de parts d'animals o plantes, per exemple os, múscul, fulles, etc.

Els fluids corporals

Sang, sèrum, plasma, líquid cefaloraquidi, saliva i líquid sinovial són fluids corporals, que ofereixen una gran font d'informació rellevant per al diagnòstic. Per tant, una preparació sofisticada de mostres de fluids corporals per a l'anàlisi és important. La primera dificultat s'associa amb l'ampli rang dinàmic dels components presents en els fluids corporals.

Determinació de la concentració de proteïnes

assaig de Bradford, l'assaig de Lowry i l'assaig d'àcid bicinconínico (BCA) són assajos comuns per determinar la concentració de proteïnes. albúmina de sèrum boví (BSA) és un dels estàndard de proteïna més freqüentment utilitzat.

Tampó de lisi

tampó de lisi ha de ser elegit d'acord amb el material cel·lular o teixit (cultiu de teixits, planta, bacteri, fongs, etc.), i si les cèl·lules estan en una estructura i el tipus d'estructura. Una àmplia gamma de lisi esmorteeix per a l'extracció de proteïnes, membranes i orgànuls es formulen amb un o més detergents. El detergent es selecciona normalment a través de proves d'assaig i error o – si està disponible – d'acord amb un protocol d'extracció de proteïna existent. El detergent ha de ser compatible amb la font de teixit i les proteïnes. En general, el detergent més suau que funciona per un teixit / proteïna específica, es tria per tal de mantenir la funcionalitat màxima de l'extracte. A més, en cas d'una extracció de les membranes i orgànuls, un detergent suau manté la membrana intacta. detergents utilitzats comunament en tampons de lisi són majoritàriament no iònic o zwitteriónico, per exemple CHAPS, desoxicolato, Triton ™ X-100, NP40, i Tween 20.
Per exemple, teixits tals com a cervell, fetge, intestí, ronyó, melsa, etc., poden ser simplement tamponat amb RIPA – però inhibidors de proteasa i DTT (per exemple, per electroforesi en gel) han de ser inclosos.
tampó de lisi per al teixit muscular esquelètic (fred gel): Tris 20 mM (pH 7,8), NaCl 137 mM, KCl 2,7 mM, MgCl2 1 mM, 1% de Triton (w / v) de glicerol, mM EDTA X-100, 10% 1 , 1 mM ditiotreitol suplementat amb proteasa i inhibidor de fosfatasa còctel
Taula de tampons comuns i el seu interval de pH. En general, aquests tampons s'utilitzen normalment en concentracions de 20-50 mM.

buffer interval de pH
Àcid cítric – Naoh 2,2 – 6,5
citrat de sodi – Àcid cítric 3,0 – 6,2
L'acetat de sodi – àcid acètic 3,6 – 5,6
sal de sodi d'àcid cacodílico – Hcl 5,0 – 7,4
MI – Naoh 5,6 – 6,8
De sodi dihidrogen fosfat – hidrogen fosfat disòdic 5,8 – 8,0
imidazol – Hcl 6,2 – 7,8
MOPS – Koh 6,6 – 7,8
clorhidrat de trietanolamina – Naoh 6,8 – 8,8
tris – Hcl 7,0 – 9,0
Hepes – Naoh 7,2 – 8,2
tricina – Naoh 7,6 – 8,6
tetraborat de sodi – àcid bòric 7,6 – 9,2
bicina – Naoh 7,7 – 8,9
glicina – Naoh 8,6 – 10,6

La majoria dels tampons mostren un pH-dependència amb la temperatura. Això és especialment cert per als tampons Tris. El pKa canvia de 8,06 a 25 ° C a 8,85 a 0 ° C.
(PH i pKa d'un tampó: pH mesura la concentració d'ions d'hidrogen en una solució aquosa pKa (= constant de dissociació àcida) és una mesura relacionada, però més específica, en què ajuda a predir com una molècula actuarà a una específica. valor de pH).

La seva

TRIzol és una solució de producte químic utilitzat per extreure l'ARN / ADN / proteïna durant l'extracció de tiocianat de guanidinio-fenol-cloroform. L'ús de la assistida per ultrasons d'extracció resultats TRIzol en alta DNA, RNA, i rendiments de proteïna de la mateixa mostra i sobresurt d'aquesta manera altres mètodes d'extracció.