Tecnologia d'ultrasons Hielscher

La lisi per sonicació: disrupció cel·lular & Extracció

La desintegració cel·lular o la lisi és una part comuna de la preparació diària de la mostra en laboratoris biotecnològics. L'objectiu de la lisi és interrompre parts de la paret cel·lular o la cèl·lula completa per alliberar molècules biològiques. L'anomenat lisat pot consistir, per exemple, en plasmid, assaigs del receptor, proteïnes, ADN, ARN, etc. Els següents passos de la lisi són el fraccionament, l'aïllament d'orgànuls i / o l'extracció i purificació de proteïnes. El material extret (= lisat) ha de ser separat i està subjecte a investigacions o aplicacions addicionals, per exemple, per a la investigació proteòmica. Els homogeneïtzadors ultrasònics són una eina comuna per a la lisis cel·lular reeixida. A mesura que la intensitat d'ultrasons es pot ajustar ajustant els paràmetres del procés, la intensitat de sonicació òptima de molt suau a molt dur es pot fixar individualment per a cada substància i mitjà per complir amb el requisit específic d'aplicació.

estructura cel·lular

Les cèl·lules estan protegits per una membrana de plasma semi-permeable que consisteix en una doble capa fosfo-lípid (bicapa també proteïna-lípid; formada per lípids hidròfobs i molècules de fòsfor hidròfils amb molècules de proteïna incrustades) i crea una barrera entre els interiors de cèl·lules (citoplasma) i el medi extracel·lular. Les cèl·lules vegetals i cèl·lules procariotes estan envoltats per una paret cel·lular. A causa de les múltiples capes de la paret cel·lular gruixuda de cel·lulosa, les cèl·lules vegetals són més difícils de lisar que les cèl·lules animals. L'interior de la cèl·lula, com ara orgànuls, nucli, mitocondri, s'estabilitza pel citoesquelet.
Per lisar les cèl·lules, que està dirigit a l'extracció i la separació dels orgànuls, proteïnes, ADN, ARNm o altres biomolècules.

La sonicació s'utilitza comunament per a la preparació de la Mostra de la matèria cel·lular.

Fig. 1: extracció per ultrasons de les cèl·lules: la secció transversal microscòpica (TS) de la tija apical de menta (Mentha piperita) mostra el mecanisme de les accions durant l'extracció per ultrasons a partir de cèl·lules (ampliació 2000X) [recurs: Vilkhu et al. 2011]

mètodes

Hi ha diversos mètodes per lisat de cèl·lules, que es poden dividir en mètodes mecànics i químics, que inclouen l'ús de detergents o dissolvents, l'aplicació d'alta pressió, o l'ús d'un molí de perles o d'una premsa francès. El desavantatge més problemàtic d'aquests mètodes és el difícil control i ajust de paràmetres de procés i d'aquesta manera l'impacte.
Les principals desavantatges de mètodes de lisi comuns:

Diferents tècniques de lisi

Taula: Els mètodes convencionals de lisi cel·lular tenen importants desavantatges

Per contra, la sonicação és una eina molt eficient i fiable per a la desintegració cel·lular que permet un control complet sobre els paràmetres de sonicació. Això garanteix una alta selectivitat en l'alliberament de materials i la puresa del producte. [Balasundaram et al. 2009] És adequat per a tots els tipus de cel·les i és fàcilment aplicable a petita i gran escala. Els ultrasons són fàcils de netejar. Un homogeneïtzador d'ultrasons sempre presenta funcions netes (CIP) i esterilitzar-se (SIP). El sonotrodo consisteix en una banya de titani massiva que es pot esmorteir o rentar en aigua o dissolvent (depenent del mitjà de treball). El manteniment d'ultrasons és degut a la seva robustesa gairebé negligible.

lisi

Lisi és un procés sensible. Durant la lisi de la protecció de la membrana cel·lular es destrueix, però, la inactivació, la desnaturalització i la degradació de les proteïnes extretes per un entorn no fisiològica (desviació del valor de pH) ha de ser evitat. Per tant, en la lisi en general es porta a terme en una solució tampó. La majoria de les dificultats sorgeixen de la ruptura cel·lular incontrolada que resulta en un alliberament no directe de tot el material intracel·lular i / o la desnaturalització del producte diana.

lisi cel·lular per ultrasons es pot utilitzar per a la preparació de mostres al laboratori i per a la producció de grans volums. Feu clic per ampliar!

Fig. 1: 200 watts homogeneïtzador ultrasònic potent UF200 ः t amb control digital i la gravació automàtica de dades per a la lisi cel·lular fiable i reproduïble.

La lisi per ultrasons

En general, la lisi de mostres en el laboratori durarà entre 15 segons i 2 minuts. Atès que la intensitat de la sonicação és molt fàcil d'ajustar per amplitud fixant un temps de sonicació així com escollint l'equipament adequat, és possible interrompre les membranes cel·lulars de forma molt suau o molt bruscament, depenent de l'estructura cel·lular i del propòsit de la lisi ( per exemple, l'extracció d'ADN requereix una sonicació més suau, l'extracció completa de proteïnes de bacteris requereix un tractament d'ultrasons més intens). La temperatura durant el procés es pot controlar mitjançant un sensor de temperatura integrat i es pot controlar fàcilment mitjançant refrigeració (bany de gel o cèl·lules de flux amb armilles de refrigeració) o mitjançant sonicació en mode pulsat. Durant la sonicació en mode de pols, els cicles de ràfegues de sonicació curts de 1 a 15 segons de durada permeten la dissipació de calor i el refredament durant els períodes intermitents més llargs.
Tots els processos d'ultrasò impulsada són completament reproduïble i escalable linealment.

Ultrasonic VialTweeter homogeneïtzador per a la preparació de la mostra simultània de fins a 10 tubs d'assaig. (Feu clic per fer més gran!)

El dispositiu ultrasònic VialTweeter permet la preparació de la mostra simultània de fins a 10 vials sota mateixes condicions de procés.

Els homogeneïtzadors ultrasònics

Diversos tipus de Els dispositius ultrasònics permeten la coincidència de la meta preparació de la mostra i per a assegurar la facilitat d'ús i comoditat d'ús. De tipus sonda ultrasonicators són els dispositius més comuns al laboratori. Ells són els més adequats per a la preparació de les petites i mitjanes mostres amb volums de 0,1 ml fins a 1000 ml. Diferents potències i sonotrodos permeten adaptar el ultrasonicador al volum de la mostra i el recipient per obtenir resultats més eficaços i eficients sonicació. El dispositiu de sonda ultrasònica és la millor opció quan les mostres individuals han de ser preparats.

Si més mostres ha de ser preparat, per exemple, 8 vials de solució de cèl·lules, dispositius com ara la VialTweeter o cuphorn ultrasònica són el homogeneïtzador més adequat per a la lisi. Diversos vials es van sotmetre a sonicació, al mateix temps, amb la mateixa intensitat. Això no només estalvia temps, sinó que també garanteix el mateix tractament de totes les mostres, el que fa que els resultats entre les mostres fiables i comparables. A més, s'evita la contaminació creuada per immersió del sonotrodo ultrasònic (també conegut com a sonda ultrasònica, banya, punta, o el dit). Atès que s'utilitzen vials, s'ometen temps de neteja i pèrdua de la mostra a causa de la decantació dels vasos.
Per volums grans, per exemple, per a la producció comercial dels extractes cel·lulars, els sistemes d'ultrasons continus amb un reactor de cèl·lula de flux són els més adequats. El flux continu i uniforme del material processat assegura una sonicació fins i tot. Tots els paràmetres del procés de desintegració ultrasònica es poden optimitzar i s'ajusten als requisits de l'aplicació i el material cel·lular específic.

procediment exemplar per lisi per ultrasons de cèl·lules bacterianes:

  • Preparació de la suspensió de cèl·lules: els sediments cel·lulars han d'estar completament suspesos en una solució tampó per homogeneïtzació (triï el seu solució tampó compatible amb l'anàlisi següent, per exemple, mètode de cromatografia específic). Afegir lisozimas i / o altres additius, si cal (que ha de ser també compatible amb mitjans de separació / purificació). Barrejar / homogeneïtzar la solució suaument sota sonicació suau fins que s'aconsegueix la suspensió completa.
  • Ultrasònica lisi: Col · locar la mostra en un bany de gel. Per a la ruptura cel·lular, sotmetre a ultrasons la suspensió a 60-90 segons ràfegues (utilitzant la manera d'impulsos de la seva ultrasonicador).
  • (., Per exemple, 10 min a 10.000 x g, a 4degC): de separació per centrifugació del lisat. Separar el sobrenedant del sediment cel·lular amb cura. El sobrenedant és el lisat cel·lular total. Després de la filtració del sobrenedant, s'obté un fluid clarificat de la proteïna cel·lular soluble.

Les aplicacions més comuns per ultrasonicators en la biologia i la biotecnologia són:

  • la preparació de l'extracte de la cèl·lula
  • trastorn de llevat, bacteris, cèl·lules vegetals, suau & teixit cel·lular dur, el material nucleic
  • L'extracció de proteïnes
  • Preparació i aïllament d'enzims
  • La producció d'antígens
  • l'extracció d'ADN i / o dirigit fragmentació
  • preparació de liposomes
homogeneïtzadors d'alta ultrasons de potència com el UIP1000hd s'utilitzen per a la disrupció cel·lular i l'extracció per lots o en mode de flux, encara que contínua. (Feu clic per fer més gran!)

sistemes de sobretaula d'ultrasons com ara la UIP1000hd (1 kW) pot processar grans volums de material biològic.

Les múltiples aplicacions de les branques d'ultrasò en els sectors de la biotecnologia, bioenginyeria, microbiologia, biologia molecular, bioquímica, immunologia, bacteriologia, virologia, la proteòmica, la genètica, la fisiologia, la biologia cel·lular, l'hematologia i la botànica.

Per a l'avaluació i optimització d'aplicacions dels clients, Hielscher Ultrasons ofereix un complet equipament Laboratori de procés ultrasònic. Si us plau, poseu-vos en contacte amb nosaltres per a més informació!

Literatura / Referències

  • Balasundaram, B.; Harrison, S.; Bracewell, D. G. (2009): Els avenços en les estratègies de llançament de productes i l'impacte en el disseny de bioprocessos. Tendències en Biotecnologia 27/8, 2009. pp. 477-485.
  • Vilkhu, K.; Manassès, R.; Mawson, R.; Ashokkumar, M. (2011): Ultrasons de recuperació i modificació d'ingredients alimentaris. En: Feng / Barbosa-Cánovas / Weiss (2011): Ultrasound Technologies per a l'Alimentació i Bioprocessos. Nova York: Springer, 2011. pp 345-368 ..

Contacti amb nosaltres / Demana més informació

Parlar amb nosaltres sobre els seus requisits de processament. Anem a recomanar els paràmetres de configuració i de processament més adequats per al seu projecte.





Tingueu en compte que Política de privacitat.