Tecnologia d'ultrasons Hielscher

Ultrasonic ADN Shearing

  • Durant ADN i ARN de cisallament, les molècules d'ADN es trenquen en trossos més petits. ADN / ARN fragmentació és un dels passos de preparació de mostres important que es requereix crear biblioteques per a la seqüenciació de pròxima generació (NGS).
  • Ultrasònic de tall d'ADN utilitza les forces de cavitació acústica per trencar l'ADN o ARN en trossos de 100 – pb 5 kb.
  • cisallament ultrasònica permet la fragmentació de l'ADN precís i adaptació a la longitud desitjada d'ADN.

Ultrasonic ADN Shearing

Hielscher ultrasons ofereix diverses solucions basades en l'ecografia per l'ADN, l'ARN i el tall de la cromatina. Triar entre un tipus de sonda ultrasonicators (per exemple UP100H) per sonicació directa usant una micropunta, o utilitzar el VialTweeeter o la cuphorn ultrasònic per a preparació d'ADN indirecta de diverses mostres simultàniament. Hielscher ofereix el dispositiu ideal tenint en compte les seves necessitats: ja sigui que es té a 1 o fins a 10 mostres, els volums de microlitre a volums de litres – processadors d'ultrasons Hielscher estan disponibles per satisfer les seves necessitats per preparar ADN, ARN i fragments de la cromatina en la longitud correcta. Reproductibilitat, fàcil operació i control precís permeten una biblioteca fiable per a la seqüenciació de pròxima generació.
En contrast amb la fragmentació de l'ADN enzimàtica, tall ultrasònic s'aplica forces de cisallament mecàniques pura sense l'addició de cap producte químic. Per l'ajust precís dels paràmetres del procés, cisallament ultrasònica produeix fragments d'ADN d'alt pes molecular (de plasmidis i d'ADN genòmic).
àcids nucleics purificats poden amplificar abans d'o després d'una etapa de fragmentació.
paràmetres de sonicació (potència, cicle d'impulsos / ràfegues, temps i temperatura) es poden controlar de manera segura a través de la configuració del programari.

avantatges:

  • control precís
  • cicles de sonicació i el temps precisament adaptables a la mida d'ADN desitjat
  • fragments d'ADN d'alt pes molecular
  • control de la temperatura
  • Ràpid
  • resultats reproduïbles
  • autoclavable
  • diverses solucions: tipus sonda, VialTweeter i Cuphorn

Els protocols per ultrasònic ADN Shearing

Per a la immunoprecipitació de la cromatina Assaig

En poques paraules, les cèl·lules van ser planchadas en plats de 60 mm de diàmetre (400.000 per plat) i transfectats amb siRNA de RhoA (tal com es descriu); després de les 72 h, es van incubar amb formaldehid (concentració final, 1%) durant 10 min a 37ºC per enllaçar les proteïnes amb l'ADN. La reacció de reticulació es va estancar amb l'addició d'un desè volum de 1,25 mol / l de glicina, que va donar una concentració final de 125 mmol / L. Les cèl · lules es van rentar dues vegades amb PBS gelat, resuspendido en un amortidor d'assaig de radioimmunoprecipitació [150 mmol / L NaCl, 1% NP40, 0,5% desoxiclol, SDS al 0,1%, EDTA 5 mmol / L, 50 mmol / L Tris-HCl (pH 8.0 )] que contenia 1 mmol / L de fluorur de fenilmetilsulfonil, 1 Ag / ml d'aprotinina i 1 Ag / ml de pepstatina A, i es manté gelat durant 30 minuts. Llavors, els lisats cel·lulars van ser sonicats sobre gel amb a Hielscher UP200S ecografia d'ultrasons (3 x 40 s, l'amplitud del 40%, cicle 1; Hielscher Ultrasons GmbH) fins cromatines reticulats van ser cisallades per produir fragments d'ADN entre 200 i 1.000 pb. Una desena part de lisat sencer es va utilitzar per quantificar la quantitat d'ADN present en diferents mostres i considerat com “ADN total d'entrada”. Els sobrenedants es van incubar amb ADN d'esperma de salmó / proteïna d'agarosa-suspensió al 50% per reduir el fons no específic. llavors immunoprecipitació es va realitzar durant la nit a 4 ° C amb 5 Ag de p65 anti-NF-NB (Upstate) o sense anticòs (control negatiu). Aquests sobrenedants van ser suplementats amb 5 mol / L de NaCl i es va escalfar durant la nit a 65 ° C per revertir proteïnes d'ADN enllaços creuats. Els immunocomplexos es van tractar addicionalment amb DNasa i proteïnasa RNasa lliure de K, i l'ADN es va purificar per extracció amb fenol / cloroform i precipitació amb etanol. PCR es va realitzar amb encebadors específics corresponents a una seqüència dins de la regió promotora del gen de l'iNOS humana (encebador p1: 5¶-GAGGGCTTTCCCA- GAACCAAG-3¶; encebador P2: GCTGGGCTACTGACCCAG- CAGTTCCAG-3¶). (Doublier et al., 2008)

Els estudis d'expressió de EGFP

Per a estudis d'expressió, el p10 soca de L. tarentolae :: recombinant F9Begfp1.4dBsat # 12 (Jena Bioscience, Alemanya) amb el gen per EGFP (Enhanced Green Fluorescent Protein), cromosòmic SSU integrat, va ser conreada en els diversos mitjans com es descriu anteriorment i addicionalment suplementat amb l 100 mg-1 Nourseotricina (Jena Bioscience, Alemanya). Durant el cultiu, es van prendre mostres d'1 ml, es va centrifugar (2000 xg, 20 ° C, 10 min) i es van rentar amb solució de NaCl al 0,9%. El sediment es resuspendió en tampó (Hepes 20 mM, EDTA 5 mM, DTT 2 mM) i es va desintegrar mitjançant sonicació amb el processador ultrasònic UP400S (Aplicació de l'energia ~ 400 Ws). Les restes cel·lulars es van eliminar per centrifugació (6000 x g, 4 ° C, 5 minuts) i es va analitzar per dodecil sulfat de sodi - electroforesi en gel de poliacrilamida (SDS-PAGE) sota condicions reductores segons el mètode de Laemmli (1970) amb 12,5% de gels de polyacralamide . EGFP expressió es va examinar en la cultura agitat. (Fritsche et al. 2007)

Hielscher's UP100H was used to prepare EHEC DNA for chip array analysis

Electroforètica anàlisi d'ADN genòmic d'E coli EDL933 sotmès a 0 - 15 min ultrasonicación. L indica l'escala d'ADN. (Basselet et al. 2008)

Sol · licitud d'informació




Tingueu en compte la nostra Política de privacitat.


immunoprecipitació de la cromatina

Ultrasonic UP100H disruptor cel·lular (100W) per a la lisi, la ruptura cel·lular i el cisallament de l'ADN.L'assaig d'immunoprecipitació de la cromatina es va realitzar utilitzant el xip-TITm Express (Active Motif, Carlsbad, CA, EUA) segons les instruccions del fabricant, amb algunes modificacions. Breument, els podòcits humans diferenciats van ser reticulat amb 1% de formaldehid durant 10 min a temperatura ambient. Les cèl·lules es van rentar amb PBS refredat en gel i la reacció de fixació es va aturar afegint 0.125 M de glicina durant 5 minuts a temperatura ambient. Les cèl·lules es van rentar de nou amb PBS refredat en gel i es rasparon de la placa. Les cèl·lules es van sedimentar per centrifugació i ressuspendre en el tampó de lisi. Després de la centrifugació, els nuclis sedimentades ressuspendre en el tampó de cisallament, es van incubar en gel durant 30 min i la cromatina es va sotmetre a cisallament per sonicació, per exemple, UP100H (Hielscher Ultrasonics GmbH, Teltow, Alemanya) al 25% de potència 5 polsos de 20 seg cada un sobre gel en fragments d'aproximadament 200-600 bp. La cromatina tallada es va centrifugar i es va obtenir el sobrenedant. Per a les immunoprecipitacions, es van incubar 60 μl de cromatina amb 1 μg d'anticossos amb NF-κB p50 (Abcam) o amb 1 μg d'anticossos Sp1 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, EUA), NF-κB p65 (Abcam, Cambridge, Regne Unit) o ​​NF-κB p50 IgG (Laboratoris Zymed, South San Francisco, CA, EUA), com a control negatiu, durant la nit a 4 ° C amb suau rotació. Els immunocomplexes lligats a comptes magnètics es van recol·lectar utilitzant un estand magnètic, es van rentar de manera extensiva i es van invertir els enllaços entre proteïnes i ADN i es va analitzar el DNA per a l'anàlisi de PCR en temps real. (Ristola et al., 2009)

preparació d'ADN EHEC per a l'anàlisi de matriu de xips de

Disposició dels lisats cel·lulars i els ADN extrets
Els sediments bacterians en suspensió en PBS a la concentració final desitjada van ser tractats amb ecografia UP100H disruptor (Hielscher GmbH, Alemanya) equipat amb una microtip MS1 (1 mm de diàmetre). La freqüència de funcionament era de 30 kHz i la potència de sortida efectiva era de 100 W. Durant l'operació, es van refredar les mostres en un bany d'aigua gelada, barrejat i centrifugat. Les mostres van ser utilitzades per a estudis de citometria de flux, mentre que per al tractament posterior, les mostres van ser sotmeses a un tractament tèrmic (95 ° C, 5 min). Els lisats de cèl·lules crues es van processar amb una barreja de fenol: cloroformo: alcohol isoamil (25: 24: 1). Un volum igual d'aquesta barreja es va afegir a la mostra de lisat, la solució va ser vortexada vigorosament durant 15 s i es va centrifugar a 15.000 xg durant 2 minuts a temperatura ambient (RT) al voltant de 22 ° C. La primera fase aquosa que conté l'ADN genòmic va ser acuradament separada i recollida en un nou tub estèrrid Eppendorf.
Posteriorment, es van sonicar mostres per fragmentar l'ADN. El pas de sonicació es va realitzar en les mateixes condicions descrites anteriorment. Per avaluar els efectes de fragmentació sobre l'ADN genòmic, es van analitzar mostres mitjançant electroforesi en gel d'agarosa.
(…) Les mostres sonicades prèviament durant 2,5 min van ser sotmeses a un pas d'extracció després del tractament tèrmic i la centrifugació. L'ADN alliberat es va extreure dues vegades amb un fenol: cloroformo: barreja d'alcohol isoamil, i després es va sotmetre a la segona sonicação per 0 a 15 min. L'electroforesi en gel d'agarosa es va utilitzar per determinar la distribució de grandària de l'ADN sotmès a la fragmentació ultrasònica posterior a l'extracció (fig. A la part superior dreta). L'ADN altament fragmentat es va evidenciar a partir de la presència d'un borrissol d'ADN en lloc de bandes d'alt pes molecular que van ser eliminades de les mostres sonicades durant 2,5 minuts o més. La sonicació més llarga va reduir gradualment les longituds de fragment a aproximadament 150 - 600 bp, i la sonicação durant 15 minuts va degradar encara més aquests fragments, com es pot veure majorment per la part superior del frotis. Així, la grandària mitjana del fragment d'ADN va disminuir gradualment amb temps d'ultrasons i el tractament de 5 min va permetre obtenir les mides dels fragments de DNA més adequats per als assaigs de matrius de xip. Finalment, es va establir el procediment de preparació d'analits d'ADN que incloïa els primers 2 minuts de tractament ultrasònic, extracció d'ADN (2 ×) i posterior sonicació de 5 min. (Basselet et al., 2008)

Immunoprecipitació de cromatina (ChIP)

Ultrasonic UP100H processador per l'ADN, l'ARN i el cisallament de la cromatina. (Feu clic per fer més gran!)Les cèl·lules HEK293 es van cultivar com es descriu anteriorment i es van fixar amb desuccinimidil-glutarato 2 mM durant 45 minuts a temperatura ambient. Posteriorment, les cèl·lules es van rentar dues vegades amb PBS. La cromatina va ser reticulada durant 10 minuts a temperatura ambient amb 1% (v / v) formaldehid i es va rentar dues vegades amb PBS gelat. La reacció de reticulació es va aturar per incubació amb glicina a una concentració final de 0,125 M durant 5 min a temperatura ambient. Després de la incubació amb tripsina, es van tallar les cèl·lules del plat de cultiu cel·lular i es van rentar dues vegades amb PBS. El pellet cel·lular es va resuspender en tampó de lisis (canonades 5 mM, pH 8.0, KCl 85 mM i 0.5% (v / v) Nonidet P-40), incubades en gel durant 10 min i homogeneïtzades amb un homogenitzador Dounce. Posteriorment, els nuclis es van pelletitzar per centrifugació (3500 xg, 5 min, 4 ° C) i es van resuspender en un tampó del nucli (Tris-HCl 50 mM, pH 8.1, EDTA 10 mM i SDS 1% (w / v). Els nuclis van ser interromputs per sonicació amb tres polsos de 20 segons en a sonicador UP50H (Hielscher Ultraschall Technologie) en un entorn de cicle de 0,5 i l'amplitud del 30%, produint fragments d'ADN genòmic amb una grandària major de 200 a 1.000 pb. Per XIP, 50 g de DNA es va diluir 4 vegades en tampó d'immunoprecipitació (16,7 mM Tris-HCl, pH 8,1, NaCl 167 mM, EDTA 1,2 mM, 1,1% (v / v) de Triton X-100, i 0,01% (w / v) SDS). (Weiske et al. 2006)

anàlisi modificació de les histones per immunoprecipitació de la cromatina (ChIP)

Breument, 6 x 106 les cèl·lules es van rentar dues vegades amb PBS i reticulat sobre la placa de cultiu durant 15 min a temperatura ambient en presència de 0,5% de formaldehid. reacció de reticulació es va interrompre mitjançant l'addició d'0,125 M de glicina. Totes les etapes posteriors es van realitzar a 48 ° C. Tots els tampons van ser pre-refrigerada i contenien inhibidors de la proteasa (Complete Mini, Roche). Les cèl·lules es van rentar dues vegades amb PBS i després es rasparon. grànuls recollits es van dissoldre en 1 ml de tampó de lisi (1% de SDS, EDTA 5 mM, 50 mM Tris pH 8) i es van sotmetre a ultrasons en un bany d'etanol fred durant 10 cicles a 100% d'amplitud utilitzant un sonicador UP50H (Hielscher, Teltow, Alemanya). la fragmentació de la cromatina es va visualitzar en un gel d'agarosa a l'1%. fragments obtinguts estaven en el rang 200-500pb. cromatina soluble es va obtenir per centrifugació de les mostres sonicadas a 14.000 durant 10 minuts a 48 ° C. La fracció soluble es va diluir 1/10 en tampó de dilució (1% Triton X-100, EDTA 2 mM, 20 mM Tris pH 8, NaCl 150 mM) i després es va dividir en alíquotes i es va emmagatzemar a 80 ° C fins al seu ús. (Rodríguez et al. 2008)

Dispositiu Potència [W] tipus Volum [ml]
VialTweeter 200 autònom 00.5 1,5
UP50H 50 de mà o standmounted 00.01 250
UP100H 100 de mà o standmounted 00.01 500
UF200 ः t 200 de mà o standmounted 00.1 1000
UP200St 200 de muntatge 00.1 1000
UP400St 400 de muntatge 5,0 2000
Cuphorn 200 L'actor 10 200
GDmini2 200 cel de flux lliure de contaminació

Sol · licitud d'informació




Tingueu en compte la nostra Política de privacitat.


Hielscher's VialTweeter is is´deal for the simultaneous preparation of multiple samples

VialTweeter per a la preparació de mostres d'ultrasons

Contacti amb nosaltres / Demana'ns!

Demanar més informació

Utilitzeu el formulari següent, si voleu sol·licitar informació addicional sobre l'homogeneïtzació d'ultrasons. Estarem encantats d'oferir-vos un sistema d'ultrasons que compleixi els vostres requisits.









Tingueu en compte que Política de privacitat.


Literatura / Referències

  • Basselet P., Wegrzyn G., Enfors S.-O., Gabig-Ciminska M. (2008): Processament de les mostres per a l'anàlisi basat en la matriu de xips d'ADN d'Escherichia coli enterohemorràgic (EHEC). Les fàbriques de cèl·lules microbianes 07:29. 2008.
  • . Doublier S., Riganti Ch, Voena C., Costamagna C., Aldieri I., Pescarmona G., Ghigo D., Bosia A. (008): RhoA silenciament reverteix la resistència a la doxorubicina en cèl·lules de càncer de còlon humà. Molecular Cancer Research juny (10), 2008.
  • Fredlund I., Gidlund A., Olsen M., Börjesson T., Spliid NHH, Simonsson M. (2008): avaluació Mètode d'extracció d'ADN a partir de micelis Fusarium i blat per down-stream en temps real quantificació PCR i correlació amb els nivells de micotoxines . Revista de Mètodes Microbiològics 2008.
  • Fritsche C., Sitz M., Weiland N., Breitling R., Pohl H.-D. (2007): Caracterització del comportament de creixement de Leishmania tarentolae - un nou sistema d'expressió per proteïnes recombinants. Revista de Microbiologia Bàsica 47, 2007. 384-393.
  • Ristola M., Arpiainen S., Saleem M. A., Mathieson P. W., Welsh G. I., Lehtonen S., Holthöfer H. (2009): Regulació de Neph3 gen en els podòcits - papers clau de factors de transcripció NF-KB i Sp1. BMC Molecular Biology 10:83, 2009.
  • Rodríguez J., Vives L., Jorda M., Morales C., Muñoz M., Vendrell I., Peinado M. A. (2008): Genome-àmplia de seguiment de no metilada d'ADN Alu repeteix en cèl·lules normals i canceroses. Nucleic Acids Vol Recerca. 36, No. 3, 2008. 770-784.
  • Weiske J. Huber O. (2006): La proteïna histidina tríada Hint1 desencadena l'apoptosi independent de la seva activitat enzimàtica. El Journal of Biological Chemistry. Vol. 281, No. 37, 2006. des 27.356-27.366.


Fets que cal saber

Ultrasònica / cavitació acústica crea forces de gran intensitat que promou els processos de cristal·lització i precipitació (clic per ampliar!)

Ultrasònic de tall d'ADN es basa en la cavitació acústica i les seves forces de cisallament hidrodinàmiques