Hielscher – Ultraschalltechnologie

Ultraschall-Extraktion und Erhaltung

Das Desintegrieren von Zellstrukturen (Lyse) mit Hilfe von Ultraschall wird bei der Extraktion von intrazellulären Bestandteilen zur mikrobiellen Inaktivierung eingesetzt.

Hintergrund

In der Mikrobiologie assoziiert man mit Ultraschall in erster Linie die Prozesse des Aufschließens von Zellen (Lyse) oder des Desintegrierens (Allinger 1975).
Werden Flüssigkeiten mit hoher Intensität beschallt, erzeugen die Schallwellen im flüssigen Medium alternierende Hochdruckzyklen (Kompression) und Niederdruckzyklen (Rarefaktion), deren Schwingungsrate von der Frequenz abhängt. Während eines Niederdruckzyklus bilden die hochenergetischen Ultraschallwellen kleine Vakuumblasen oder Hohlräume in der Flüssigkeit. Erreichen diese Blasen ein Volumen, bei dem sie keine weitere Energie absorbieren können, platzen sie während eines Hochdruckzyklus. Dieses Phänomen wird als Kavitation bezeichnet. Während der Implosion werden lokal sehr hohe Temperaturen (ca. 5000K) und Drücke (ca. 2000atm) erreicht. Zudem entstehen durch die Implosion der Kavitationsblasen Flüssigkeitsstrahlen mit Geschwindigkeiten von bis zu 280m/s. Die Scherkräfte schließen die Zellhülle mechanisch auf und steigern dadurch den Materialaustausch. Ultraschall kann sowohl destruktive wie auch konstruktive Effekte auf Zellen haben, was jeweils von den Parametern, mit denen der Ultraschall eingesetzt wird, abhängt.

Desintegration von Zellen

Durch intensive Beschallung mit Ultraschall können aus den Zellen oder den subzellulären Organellen infolge der Zelldesintegration Enzyme oder Proteine freigesetzt werden. Bei der chemischen Verbindung, die in einem Lösungsmittel gelöst werden muss, handelt es sich um eine eingeschlossene, unlösliche Struktur. Um diese extrahieren zu können, muss die Zellmembran zerstört werden. Bei diesem Verfahren, der Zelldesintegration, handelt es sich um einen sensiblen Vorgang, denn die Zellwände besitzen die Fähigkeit hohen osmotischen Drücken im Inneren zu widerstehen. Eine genaue Kontrolle des Zellaufschlusses ist daher notwendig, um eine ungehinderte Freisetzung aller interzellulären Stoffe, einschließlich der Zelltrümmer und Nukleinsäure, oder eine Stoffdenaturierung zu vermeiden. Ultraschall bietet eine genau kontrollierbare Methode der Zelldesintegration, denn durch die mechanischen Effekte des Ultraschalls wird erreicht, dass das Lösungsmittel das Zellmaterial schneller und vollständiger durchdringt. Dadurch wird auch der Masseaustausch gesteigert. Ultraschall erzielt ein höheres Eindringen des Lösungsmittels in die Pflanzengewebe und erhöht hiermit den Masseaustausch. Die Ultraschallwellen zerstören die Zellwände durch Kavitationskräfte und vereinfachen damit die Freisetzung der Matrixkomponenten.

Der Stoffaustausch

Mit Ultraschall ist es generell möglich, die Durchlässigkeit der Zellmembran für Ionen (Mummery 1978) zu erreichen; somit kann die Empfindlichkeit und Selektivität der Zellwände bedeutend reduziert werden. Zusätzlich unterstützen die mechanischen Kräfte des Ultraschalls das Verteilen des Lösungsmittels im Gewebe. Da Ultraschall die Zellwände mechanisch durch die Kavitationsscherkräfte aufbricht, wird der Transfer von der Zelle in das Lösungsmittel erleichtert. Eine wichtige Konsequenz der Partikelgrößenreduktion mittels Ultraschallkavitation ist die Vergrößerung der Partikeloberfläche, die die Kontaktfläche zwischen dem Feststoff und der flüssigen Phase darstellt, und somit mehr Reaktionsfläche bietet.

Die Extraktion von Proteinen und Enzymen

Besonders bei der Extraktion von Enzymen und Proteinen, die sich in Zellen oder in subzellulären Organellen befinden, erweist sich die Anwendung von hochintensivem Ultraschall (Kim 1989) als äußerst effektiv und einzigartig hinsichtlich seiner Vorteile. So zeigen sich speziell bei der Extraktion organischer Verbindungen, die sich im Inneren von Pflanzen oder Saaten befinden, mit Hilfe von Lösungsmitteln und Ultraschall signifikante Steigerungen bei den Ergebnissen. Zudem zeigt Ultraschall potentielle Einsatzmöglichkeiten bei der Extraktion und Isolation neuer, zukunftsträchtiger bioaktiver Stoffe, wie z. B. bei nicht genutzten Nebenprodukten, die während der laufenden Prozesse anfallen. Ultraschall kann zudem dazu beitragen, dass die Effekte von enzymatischen Behandlungen intensiviert werden und dadurch die benötigte Menge an Enzymen verringert oder der Ertrag chemischer Stoffe, die für die Extraktion relevant sind, gesteigert werden können.

Lipide und Proteine

Die Beschallung mit Ultraschall wird häufig eingesetzt, um die Extraktion von Lipiden und Proteinen aus Pflanzensaaten, so wie beispielsweise aus Sojabohnen (z. B. Mehl oder entfettete Sojabohnen) oder anderen Ölsaaten zu steigern. Dabei vereinfacht das Zerstören der Zellwände das (heiße oder kalte) Pressen der Saaten und verringert dabei die Öl- und Fettrückstände im Presskuchen.

Der Einfluss ultraschallgestützter Extraktion auf die Gewinnung disperser Proteine wurde von Moulton et al. gezeigt. Durch die Beschallung erhöht sich die Ausbeute an dispersen Proteinen in zunehmendem Maße, so dass sich das Verhältnis von Flocken/Lösungsmittel von 1:10 auf 1:30 ändert. Es ist wissenschaftlich nachgewiesen, dass es mit Ultraschall möglich ist, Sojaproteine bei fast jeder großtechnischen Durchsatzrate zu peptisieren und dass die benötigte Ultraschallenergie am niedrigsten war, wenn dickflüssigere Slurries (halbflüssige Breie) verwendet wurden (Moulton et al. 1982).

Das Verfahren ist anwendbar bei: Zitrusölen aus Früchten, Ölextraktion aus Senfkörnern, Erdnüssen, Rübsaaten, Kräuterölen (Echinacea), Raps, Soja und Getreide.

Das Freisetzen von phenolischen Komponenten und von Anthozyanin

Enzyme, wie Pektinase, Cellulase und Hemicellulase, werden in größeren Maßstab bei der Behandlung von (Frucht-) Säften eingesetzt, mit dem Ziel die Zellwände zu degradieren bzw. abzubauen und die Saftextrahierbarkeit zu verbessern. Das Aufbrechen der Zellwandmatrix setzt Bestandteile, wie z. B. phenolische Komponenten in Säften, frei. Mit Hilfe von Ultraschall wird der Extraktionsprozess gesteigert und infolgedessen wird eine Anreicherung an phenolischen Komponenten, Alkaloiden und Safterträgen erreicht, die sonst für gewöhnlich im Presskuchen zurückbleiben.

Die Vorzüge der Ultraschallbehandlung auf das Freisetzen von phenolischen Komponenten und Anthocyaninen aus Trauben- und Beerengrundsubstanz – speziell aus Blaubeeren/Heidelbeeren (Vaccinium myrtillus) und Schwarzen Johannisbeeren (Ribes nigrum) in Säften – wurde von der VTT Biotechnology, Finnland (MAXFUN EU-Projekt) untersucht. Dabei wurde nach dem Tauen, Maischen und der enzymatischen Behandlung ein Ultraschallprozessor UIP2000hd eingesetzt. Das enzymatische Aufbrechen der Zellwände (mit den Enzymen Pectinex BE-3L für die Blaubeeren und Biopectinase CCM für Schwarze Johannisbeeren) wurde verbessert, sobald das Verfahren mit Ultraschall kombiniert und aufgerüstet wurde.

"Der Einsatz von US (Ultraschall) steigert die Konzentration der phenolischen Komponenten in Blaubeersaft um mehr als 15%. [...] Noch bedeutender war der Einfluss von US (Ultraschall) bei der Schwarzen Johannisbeere, welche in der Saftgewinnung und -behandlung aufgrund ihres hohen Pektingehaltes und eines anderen Zellwandaufbaues als die noch schwieriger zu bearbeitende Beere gilt. [...] Die Konzentration der phenolischen Komponenten stieg im Saft um 15-25%, wenn nach der enzymatischen Behandlung eine Beschallung mit Ultraschall erfolgte. " (Mokkila et al. 2004)

Die mikrobielle Inaktivierung und die Inaktivierung von Enzymen

Die mikrobielle und enzymatische Inaktivierung (Haltbarmachung), beispielsweise in Fruchtsäften und Soßen, ist ein weiteres Anwendungsgebiet für Ultraschall im Bereich der Nahrungsmittelherstellung. Heutzutage ist das Haltbarmachen durch eine Temperaturerhöhung für kurzandauernde Phasen – das sogenannte Pasteurisieren – die am weitesten verbreitete Methode zur mikrobiellen oder enzymatischen Inaktivierung. Diese Inaktivierung führt zu einer längeren Haltbarkeitsdauer. Da die Nahrungsmittel hohen Temperaturen ausgesetzt werden, erweisen sich diese thermischen Verfahren für viele Lebensmittelprodukte als nachteilig. Die Gewinnung neuer Substanzen aus hitzekatalysierten Reaktionen, die Modifikation von Makromolekülen und ebenso die Zerstörung pflanzlichen und tierischen Gewebes können den Qualitätsverlust reduzieren. Außerdem kann ein thermisches Verfahren unerwünschte Veränderungen der sensorischen Eigenschaften, so z. B. hinsichtlich Textur, Farbe, Geschmack und Geruch, und der Qualität der Nährstoffe, so z. B. hinsichtlich der Vitamine und Proteine, verursachen. Ultraschall stellt eine effiziente nicht-thermische Alternative für diese Verfahren dar.

Die Temperaturen, die an lokalen Stellen durch Kavitation entstehen, und die erzeugten Radikale können zu einer Enzyminaktivierung durch Beschallung führen (El’piner 1964). Bei ausreichend geringen Beschallungsintensitäten können die strukturellen und metabolischen Veränderungen sogar in der Zelle beobachtet werden, ohne diese zu zerstören. Das Wirken der Peroxidase, die in den meisten rohen und ungekochten Früchten und Gemüse enthalten ist und die vor allem mit dem Entstehen von Fremdaromen und braun verfärbenden Pigmenten assoziiert wird, kann durch den Einsatz von Ultraschall nachhaltig reduziert werden. Hitzebeständige Enzyme, wie die Lipasen und Proteasen, die ein Ultrahocherhitzen unbeschadet überstehen und die die Qualität und die Haltbarkeit von wärmebehandelter Milch und anderen Milchprodukten beeinträchtigen, können durch eine kombinierte Behandlung mit Ultraschall, Temperatur und Druck (Mano-Thermo-Sonication) wesentlich effektiver inaktiviert werden.

Ultraschall hat sein Potential auch bei der Abtötung von über Nahrungsmittel übertragenen Erregern wie E.coli, Salmonellae, Ascaris, Giargia, Cryptosporidium cysts und dem Poliovirus gezeigt

Das Verfahren ist anwendbar bei: der Haltbarmachung von Konfitüre, Marmelade oder Toppings, z. B. Eiscreme, Fruchtsäfte, Soßen, Fleischprodukte und Milchprodukte.

Ultraschall und seine Synergieeffekte mit Temperatur und Druck

Häufig ist Ultraschall noch effektiver, wenn er mit anderen anti-mikrobiellen Methoden kombiniert wird, so beispielsweise mit:

  • Thermo-Sonication, z. B. Kombination aus Temperatur und Ultraschall
  • Mano-Sonication, z. B. Kombination aus Druck und Ultraschall
  • Mano-Thermo-Sonication, z. B. Kombination aus Druck, Temperatur und Ultraschall

Die Anwendung von Ultraschall in Kombination mit Temperatur und/oder Druck ist besonders empfehlenswert bei Bacillus subtilis, Bacillus coagulans, Bacillus cereus, Bacillus sterothermophilus, Saccharomyces cerevisiae und Aeromonas hydrophila.

Prozessentwicklung

Im Gegensatz zu anderen nicht-thermischen Prozessen, wie hydrostatischer Druck (HP), komprimiertes Kohlenstoffdioxid (cCo2) und überkritisches Kohlenstoffdioxid (ScCO2) und pulsierende, hochenergetische elektrische Felder (HELP), kann Ultraschall problemlos in kleinem Maßstab in Labor- oder Technikumsgröße getestet werden. Dabei können die gewonnenen Daten für ein anschließendes Scale-Up verwendet werden, da sich die Prozessergebnisse linear zur eingesetzten Ultraschallkapazität entwickeln. Die Kavitationsintensität und die Kavitationseigenschaften können einfach und problemlos für spezifische Extraktionen an die jeweils spezifischen Zielobjekte angepasst werden. So können die Amplitude und der Druck auf einer breiten Skala eingestellt werden, um so z. B. die energieeffizienteste Extraktionskonfiguration herauszufinden. Feste Gewebe sollten vor dem Beschallen mit Ultraschall mazeriert, feingemahlen oder pulverisiert werden.

E.coli

Für die Herstellung kleiner Mengen rekombinanter Proteine für Studien und die Charakterisierung ihrer biologischen Eigenschaften ist E.coli das am häufigsten verwendete Bakterium. Marker wie Polyhistidinschwänze, Beta-Galctosidase oder maltosebindende Proteine, werden im Allgemeinen für rekombinante Proteine gewählt, um diese von Zellextrakten mit einem Reinheitsgrad für die meisten analytischen Verwendungszwecke abtrennen zu können. Ultraschall ermöglicht es, die Proteinabgabe zu maximieren, besonders dann, wenn der Produktionsertrag gering ist und die Struktur und die Funktionsfähigkeit des rekombinanten Proteins erhalten werden soll.

Der Aufschluß von E.coli-Zellen, um die gesamten Proteine zu extrahieren, und die Chrymosin-Extraktion wurden von Kim und Zayas untersucht.

Oxidation

Bei kontrollierten Beschallungsintensitäten kann der Einsatz von Ultraschall bei Biotransformationen und bei Fermentationsprozessen einen verbesserten Ablauf der Bioprozesse bewirken. Die Verbesserung der Bioprozessabläufe ist auf induzierte biologische Effekte und den vereinfachten zellulären Massetransfer zurückzuführen. Der Einfluss eines kontrollierten Ultraschalleinsatzes (20kHz) auf die Oxidation von Cholesterol zu Cholestenone bei ruhenden Zellen des Rhodococcus erythropolis ATCC 25544 (früher auch Nocardia erythropolis) wurden von Bar untersucht.

Cholesterol + O2 = cholest-4-en-3-one + H2O2

Dieser Vorgang ist typisch für die mikrobielle Transformation von Sterolen und Steroiden, in denen das Substrat und die Produkte wasserunlösliche Feststoffe sind. Demzufolge ist dieser Vorgang, in dem sowohl die Zellen als auch die Feststoffe durch die vom Ultraschall ausgehenden Effekte beeinflusst werden, nahezu einzigartig (Bar, 1987). Bar konnte beobachten, dass bei einer ausreichend geringen Ultraschallintensität, bei der die Struktur der Zellen und die metabolische Aktivität aufrecht erhalten bleiben, eine erhebliche Steigerung der kinetischen Geschwindigkeit bei der Biotransformation in mikrobiellen Slurries erfolgt. Diese mikrobiellen Slurries mit 1,0 und 2,5g/l Cholesterol wurden alle 10min für 5 Sekunden mit einer Intensität von 0,2W/cm² beschallt. Dabei zeigte Ultraschall keine Auswirkungen auf die enzymatische Oxidation (2,5g/l) durch Cholesteroloxidase.

Eine vorteilhafte Technologie

Die Verwendung von Ultraschallkavitation bei der Extraktion und der Haltbarmachung von Nahrungsmitteln ist eine neue, äußerst leistungsstarke Prozesstechnologie, die in ihrer Anwendung nicht nur sicher und umweltfreundlich, sondern auch effizient und ökonomisch ist. Der homogenisierende und konservierende (haltbarmachende) Effekt ist problemlos anwendbar bei Säften und Pürees (z. B. Orange, Apfel, Grapefruit, Mango, Trauben, Pflaume) ebenso wie bei gemüsebasierten Soßen und Suppen (z. B. Tomatensoße oder Spargelsuppe).

Allinger, H. (1975): American Laboratory, 7 (10), 75 (1975).

Bar, R. (1987): Ultrasound Enhanced Bioprocesses, in: Biotechnology and Engineering, Vol. 32, Pp. 655-663 (1987).

El’piner, I.E. (1964): Ultrasound: Physical, Chemical, and Biological Effects (Consultants Bureau, New York, 1964), 53-78.

Kim, S.M. und Zayas, J.F. (1989): Processing parameter of chymosin extraction by ultrasound; in J. Food Sci. 54: 700.

Mokkila, M., Mustranta, A., Buchert, J., Poutanen, K (2004): Combining power ultrasound with enzymes in berry juice processing, at: 2nd Int. Conf. Biocatalysis of Food and Drinks, 19-22.9.2004, Stuttgart, Germany.

Moulton, K.J., Wang, L.C. (1982): A Pilot-Plant Study of Continuous Ultrasonic Extraction of Soybean Protein, in: Journal of Food Science, Volume 47, 1982.

Mummery, C.L. (1978): The effect of ultrasound on fibroblasts in vitro, in: Ph.D. Thesis, University of London, London, England, 1978.